褪黑素减轻吸烟大鼠颈动脉的氧化损伤

杨根欢，汪 岩，廖鹏志，贾玉龙

(首都医科大学附属北京天坛医院 血管外科，北京 100070)

吸烟是一严重危害人类健康的社会行为，目前中国人口中吸烟者所占比例较大。吸烟是导致动脉粥样硬化相关性疾病的重要原因之一，它能够引起冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死及动脉硬化闭塞症等[1]。研究表明吸烟可以通过一系列复杂的机制引起血管内皮的氧化损伤，进而导致心血管疾病的发生[2]。褪黑素在人体内广泛分布，是一高效的抗氧化剂，具有保护血管内皮细胞的作用[3]。本研究阐明了褪黑素能够降低吸烟大鼠颈动脉内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量，进而减轻其氧化损伤。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

SPF级雄性SD大鼠20只，平均体质量350 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号: SCXK(京)20120001]；褪黑素(Sigma-Aldrich公司)；荧光探针2’,7’-DCFH-DA试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology公司)；香烟(焦油13 mg/支，尼古丁1.2 mg/支)；NF-κB抗体、eNOS抗体(CST公司)；MCP-1抗体(Santa Cruz公司)；ICAM-1抗体、VCAM-1抗体(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组和处理：将大鼠随机分为对照组(control)、吸烟组(smoking；每天定时置于香烟烟雾暴露装置中，每天共暴露于10支香烟烟雾中)和褪黑素(melatonin; 皮下注射，5 mg/kg，每日1次)干预组，每组5只。

1.2.2 大鼠颈动脉中ROS含量的检测：7 d后将各组大鼠颈动脉取出，马上用无菌0.9%氯化钠溶液冲洗干净。将颈动脉置入内皮细胞培养基稀释的2’,7’-DCFH-DA(1∶3 000)中，37 ℃、5%的CO2中孵育20 min。将颈动脉用无血清的培养基冲洗3次后，置入盛有培养基的培养皿中。于小动物活体成像系统(IVIS Spectrum Imaging System)中定量检测其荧光强度并拍照。

1.2.3 Western blot检测NF-κB、eNOS、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达：将600 μL的SDS组织裂解液加入保存于液氮中的大鼠颈动脉，于研钵中研磨成匀浆。常规方法行组织蛋白的提取及蛋白浓度的测定。将总量为20 μg的蛋白上样，于120 V恒压下电泳约90 min，320 mA恒流下进行转膜，室温下用5%的脱脂牛奶封闭60 min，4 ℃下用一抗孵育12 h(NF-κB 1∶2 000；eNOS 1∶2 000；MCP-1 1∶2 000； ICAM-1 1∶500；VCAM-1 1∶500)，TBST洗膜3次后于室温下行二抗(1∶5 000)孵育1 h，用辣根过氧化物酶化学发光法检测目标蛋白的表达。用Alpha EaseFC system 软件(Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA)分析Western blot的实验结果，测量出目标蛋白以及内参的吸光度值，将其比值进行统计分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组实验大鼠的颈动脉内ROS的含量

吸烟组大鼠颈动脉内ROS含量显著高于对照组(P<0.01)，褪黑素干预组大鼠颈动脉内ROS含量显著回降(P<0.01)(图1)。

A.control; B.melatonin; C.smoking; D.smoking+melatonin;*P<0.01)compared with melatonin or control#P<0.01)compared with smoking

2.2 各组实验大鼠的颈动脉内NF-κB的表达情况

吸烟组大鼠的颈动脉内NF-κB表达显著高于对照组(P<0.01)，褪黑素干预组颈动脉内NF-κB表达显著回降(P<0.05)(图2)。

*P<0.01 compared with melatonin or control;#P<0.01 compared with smoking图2 各组实验大鼠的颈动脉内NF-κB的表达Fig 2 Expression of NF-κB in the carotid artery of

2.3 各组实验大鼠的颈动脉内eNOS的表达情况

吸烟组大鼠的颈动脉内eNOS表达显著低于对照组(P<0.01)，褪黑素干预组颈动脉内eNOS表达显著回升(P<0.01)(图3)。

2.4 各组实验大鼠的颈动脉内MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表达情况

吸烟组大鼠颈动脉内的MCP-1、VCAM-1和ICAM-1表达显著高于对照组(P<0.01)，褪黑素干预组颈动脉内MCP-1、VCAM-1和ICAM-1表达显著回降(P<0.05)(图4)。

*P<0.01 compared with melatonin or control group;#P<0.05 compared with smoking group图3 各组实验大鼠的颈动脉内eNOS的表达Fig 3 Expression of eNOS in the carotid artery of

3 讨论

吸烟是引起血管损伤最重要的原因之一。香烟烟雾中包含5 000多种有毒有害的化学物质，比如一氧化碳、氮氧化物、活性氧和羟基化合物等[4]。从物理性状上讲，香烟烟雾可以分为气体性的香烟烟雾和颗粒性的香烟烟雾[5]。研究发现，水溶性的毒性物质在香烟烟雾中占很大的比例，这些毒性物质能够通过肺的气体交换而进入人体的血液循环中，从而损伤人体的组织和细胞，而氧化损伤便是其中非常重要的一种[6]。有研究表明，吸烟可以降低人体的抗氧化能力，吸烟者血浆中的抗氧化物质明显低于非吸烟者[7]。抗氧化剂维生素C能够明显改善吸烟者的血管内皮功能[8]。褪黑素能够被人体内的很多组织器官合成和分泌，它的分子质量小且脂溶性高，可以自由通过细胞膜而到达几乎所有的细胞和亚细胞结构[9]。研究发现褪黑素在细胞中能够发挥重要的抗氧化和抗感染作用，在多种血管疾病中具有重要的保护作用[10]。

*P<0.01 compared with melatonin or control;#P<0.05 compared with smoking图4 各组实验大鼠的颈动脉内MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表达Fig 4 Expression of MCP-1, ICAM-1 and VCAM-1 in the carotid artery of various n=5)

本研究中，给予实验大鼠香烟烟雾暴露后，其颈动脉内的活性氧显著增多，而注射褪黑素后颈动脉内的活性氧明显减少。这表明香烟烟雾能够对血管造成氧化损伤。进一步的结果显示，香烟烟雾能够诱导实验大鼠颈动脉内的NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达，而应用褪黑素后这些蛋白的表达水平显著降低。这说明NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1参与了吸烟引起血管氧化损伤的过程。目前已有研究表明NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1作为重要的细胞因子不但介入炎性反应，而且是细胞氧化损伤过程中的关键参与者[4,11]，这与本研究的结果相符。而NF-κB作为核心炎性因子则可以诱导MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表达[12]。结合本研究结果，可以推测褪黑素能够通过抑制NF-κB、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的表达进而减轻吸烟引起的大鼠颈动脉的氧化损伤。同时本实验尚对血管内源性的保护因子eNOS进行了研究，发现吸烟能够明显抑制eNOS的表达，而应用褪黑素则可使eNOS回升。已有研究表明，在心血管疾病的氧化应激的病理生理过程中，eNOS能够发挥重要的保护作用[13]。综上，本研究提示褪黑素在减轻吸烟引起的血管氧化损伤方面具有潜在的临床应用价值。