“五味甘露”药液浸浴对缺血脑卒中大鼠记忆功能影响研究

才 多，周云霞，何志玲，岳 萍

(1.西藏自治区藏医院，西藏 拉萨 850000；2.河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001；3.天津中医药大学，天津 301617；4.中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所，天津 300072)

缺血性脑卒中(Cerebral ischemic stroke)是对脑供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足所导致脑组织坏死的总称。当前脑卒中是我国成年人致死、致残的首位病因[1]，其中2016年我国缺血性脑卒中发病率为276.75/10万，患病率为1762.77/10万[2]，且具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点。卒中后认知功能障碍是严重影响患者生活质量及生存时间的重要因素，给患者、家庭、社会均带来沉重负担。研究表明，卒中后认知功能障碍与患者偏瘫呈显著正相关，且认知功能障碍较重的急性卒中患者偏瘫程度较重[3]。在藏医临床实践中，各地藏医院普遍将藏医药浴疗法用于治疗缺血性卒中偏瘫，并取得了显著疗效[4]，但对于认知功能的改善情况则缺乏有效研究。本研究采用藏医药浴基础方“五味甘露方”制取药液，对MCAO大鼠模型进行浸浴治疗，旨在探索传统藏医药浴疗法对缺血脑卒中大鼠记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠30只,体重(200±20)g，日龄(40±5)d，适应性饲养1周。

1.2 药液制备

选择藏麻黄、水柏枝、大籽蒿、圆柏、黄花杜鹃(由西藏自治区藏医院提供)5种藏药材，按照临床常用比例混合，打粉，采用两种方法制备五味甘露药液。煎煮法：将原药材各取50 g置于药锅中，加水没过药材，浸泡12 h后直接煎煮；发酵法：取500 g青稞置于容器中，加入等比例的水浸泡24 h，煎煮至青稞开花后加入原药材各50 g，煮沸，待冷却至室温后加入酒曲进行发酵，为期2 d，加入药量3倍的凉水使药液浸出，3 h后倒出药液，继续加入凉水使药液浸出，重复3次，将3次所得药液混合。

1.3 实验药品及试剂

Trizol(批号：15596-026，Invitrogen公司)，氯仿、异丙醇、无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)，DEPC水(北京索莱宝科技有限公司)，TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(批号：KR104-02、FP205，天根生物科技有限公司)。

1.4 实验仪器

Morris水迷宫、涡旋振荡仪(仪器型号：QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，离心机(仪器型号：Centrifuge 5415D，Eppendorf公司)，生物分光光度计(仪器型号：BioPhotometer，Eppendorf公司)，荧光定量PCR仪(仪器型号：Connect CFXTM，BIO-RAD公司)。

1.5 大鼠模型制备

参照Longa线栓法建立右侧大脑中动脉栓塞模型：将大鼠腹腔注射麻醉后仰卧固定于手术台，颈部皮肤正中切口，暴露皮下组织和肌肉、右侧颈总动脉，分离右侧颈外动脉和颈内动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉。用眼科剪剪开颈总动脉约1 mm，用0.28 mm 标准鱼线前端浸蜡0.5 mm后，插入颈内外动脉约(17±0.5)mm处，感觉有阻力后停止(即达到较细大脑前动脉同时闭塞大脑中动脉)，剪去多余线体，逐层缝合皮肤。根据longa 5分制评分标准进行神经功能评定，将神经功能评分达2分～5分者纳入实验。

1.6 干预方法

将模型大鼠随机分为模型组、发酵优选组、煎煮优选组、热水组，各组水池中加入定量浴液，每天分别对四组大鼠施加浸浴干预。水池中心设置一未露出水面的木桩以备大鼠抓握，让其自由游泳或在水浴浸浴，尽量使其头部以下全身浸泡于液体。每天20 min，连续15 d，15 d干预过程结束后对各项指标进行观察比较。实验前对大鼠完成水迷宫练习，练习5 d，每天2次。

1.7 检测方法

1.7.1 神经行为学评分

分别于造模24 h、7 d、14 d进行神经行为学评分。0分：无神经功能缺失；1分：不能完全伸直左前肢；2分：行走时断续向左侧转圈；3分：向左侧持续转圈；4分：向左侧倾倒；5分：不能自动行走和意识水平下降。分数越高,动物行为障碍越严重。

1.7.2 水迷宫试验检测

试验共分为A、B、C、D 4个象限。大鼠训练前加自来水于水迷宫中，将平台置于D象限水面下2 cm左右，使其可于实验光线下对大鼠不可见。试验均于9：00～15：00进行，需保持室内安静，灯光状态及物品放置一致，水温(23±2)℃。第1天～4天对大鼠进行定位航行：从2个象限按照逆时针方向将大鼠面向池壁放于水中,观察且计时60 s。采用摄像系统记录大鼠寻找且爬上平台的时间为逃避潜伏期,若大鼠60 s内未找到平台,则引导其至平台,让其停留15 s,逃避潜伏期计为60 s，记录实验动物第一次上台前总的行路程，称为总路程，完成后以4 d的逃避潜伏期反映大鼠的学习能力。第5天进行空间探索实验：将平台撤除,从距原平台最远的B象限将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠在60 s内各象限游泳时间，空间探索时间以在原平台所在D象限游泳时间,作为记忆成绩，计算跨平台次数。

1.7.3 荧光定量PCR检测

采用Realtime PCR法对大鼠海马BDNF mRNA和VEGF mRNA基因表达进行测定，以NADPH为参照，每组取3例，每例重复检测1次。应用Exicycler Analysia程序生成数据进行分析，得到基因表达的相对定量结果。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 行为学改变

24 h、7 d、14 d时间节点分别检测各组神经功能评分，结果显示：7 d和14 d发酵组的大鼠神经行为学评分均明显小于模型组(P<0.05)，动物行为障碍减轻。14 d时发酵组的大鼠神经行为学评分均明显小于热水组(P<0.05)，动物行为障碍减轻(见表1)。

表1 “五味甘露”药液对缺血脑卒中大鼠神经行为学评分的影响

时间模型组热水组煎煮组发酵组24h3.800±0.843.80±0.843.60±0.543.80±0.847d4.00±0.003.67±0.583.33±0.583.00±0.001)14d4.67±0.584.33±0.584.00±1.003.00±0.001)2)注:1)与发酵组比较,P<0.05;2)与热水组比较,P<0.05。

7 d、14 d各组进行水迷宫试验，潜伏期结果显示：煎煮组、发酵组大鼠的潜伏期短于模型组(P<0.05)。煎煮组和发酵组大鼠潜伏期明显短于热水组(P<0.05)。14 d发酵组大鼠的潜伏期明显短于煎煮组(P<0.05)。见表2。

总路程结果显示：与模型组相比，发酵组大鼠的总路程明显缩短(P<0.05)。与热水组比较，发酵组大鼠总路程明显缩短(P<0.05)。见表3。

穿越站台次数结果显示：与模型组相比，7 d时未发酵组和发酵组、14 d发酵组的大鼠穿越站台次数均明显增加(P<0.05)。与热水组相比，7 d时未发酵组和发酵组、14 d发酵组的大鼠穿越站台次数均明显增加(P<0.05)。发酵组与未发酵组相比大鼠穿越站台次数均明显增加(P<0.05)。见表4。

表2 “五味甘露”药液对缺血脑卒中大鼠水迷宫试验潜伏期的影响

时间模型组热水组煎煮组发酵组7d28.68±1.4526.07±3.3819.94±2.431)13.72±0.851)2)14d29.04±1.6626.08±3.8519.06±1.551)2)12.22±1.261)2)3)注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与热水组比较,P<0.05;3)与煎煮组比较,P<0.05。

表3 “五味甘露”药液对缺血脑卒中大鼠水迷宫试验总路程的影响

时间模型组热水组煎煮组发酵组7d607.13±146.03602.34±88.92466.19±33.24283.21±49.991)2)14d642.94±166.55627.73±112.28417.04±41.21236.35±45.041)2)注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与热水组比较,P<0.05。

表4 “五味甘露”药液对缺血脑卒中大鼠水迷宫试验穿越站台次数的影响

时间模型组热水组煎煮组发酵组7d0.83±0.290.83±0.291.67±0.291)2)3.67±0.581)2)3)14d1.17±0.291.00±0.501.50±0.874.33±0.291)2)3)注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与热水组比较,P<0.05;3)与未发酵比较,P<0.05。

2.2 分子生物学改变

模型组、发酵优选组、煎煮组、热水组大鼠进行海马取材，提取RNA进行相关基因检测。结果显示：发酵组大鼠的BDNF表达高于模型组；热水组、煎煮组、发酵组大鼠VEGF的表达均高于模型组(P<0.05)，且发酵组VEGF的表达高于热水组(P<0.05)。见表5。

表5 “五味甘露”药液对缺血脑卒中大鼠Pcr统计结果的影响

模型组热水组煎煮组发酵组BDNF1.0167±0.215481.4867±0.41861.9800±0.5902.7533±0.769501)VEGF0.9133±0.075061.2533±0.075061)2.02±0.45311)2.5267±0.466081)2)注:1)与模型组比较,P<0.05;2)与热水组比较,P<0.05。

3 讨 论

缺血性脑卒中在藏医中属于神志病“萨志布病”的范畴。藏医传统理论认为，萨志布病是由贪、嗔、痴所致，三邪引发三因之隆及七精之血紊乱，进而出现昏倒、知觉丧失、不语、口斜、躯瘫等病症。藏医《四部医典》将“萨志布”分为水萨志布、火萨志布，并在治疗中采用“药械食行”四大疗法加以治疗，积累了丰富的临床经验[5]。藏药浴作为外治疗法中的缓治疗法，在改善缺血性卒中的偏瘫方面已显示了积极效果，有报道认为，藏药浴治疗偏瘫总有效率可达95.24 %[4]。本实验结果证实了药液浸浴对大鼠认知功能的改善程度明显优于对照组，体现了藏医药浴疗法对缺血性卒中所致认知功能障碍的改善客观有效。

藏医药浴疗法是藏医传统疗法，其重要特色即以“五味甘露”为主方，以发酵为关键制备工艺。目前藏医临床中对“五味甘露”的组方具有广泛共识，即采用圆柏枝、杜鹃花、水柏枝、藏麻黄、大籽蒿5种藏药，按照一定比例合理配制，充分发挥各自药性达到预期疗效；发酵工艺是以五味甘露方为主剂、青稞为辅剂，经浸泡、煮制、发酵等程序制取药液，该工艺属自然发酵，所需时间长，过程烦琐[6]。因而近年又出现了直接煎煮或直接加入乙醇等改良的药液制备方法，但发酵与非发酵两类药液的疗效差异则未见报告。本实验设置了发酵和直接煎煮两组，并与对照组分别比较，结果显示：发酵组能使神经功能行为评分明显减小、动物行为障碍减轻，并可缩短大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期和总路程，增加大鼠单位时间内通过原平台位置次数，证明发酵组疗效优于直接煎煮，肯定了发酵工艺对于藏药浴临床疗效的重要性，提示在临床中应该对这种传统发酵工艺加以认真传承和利用。

缺血性卒中所致认知功能障碍，一般认为与脑血管损伤及内皮功能异常有关，尤其是皮层、丘脑、海马的缺血性病变引起线粒体功能障碍、微循环障碍及脂质过氧化等缺血缺氧性脑损害，进而危害海马组织、降低大鼠学习记忆功能[7]。海马是学习记忆形成的关键结构，且对缺血缺氧改变敏感。已有研究表明，藏药浴能促进血液循环,加强机体代谢，恢复已麻痹的血管运动神经,并促进中枢神经系统及血液循环系统功能[4]，推测了该疗法对于改善脑血管功能、提高认知功能的可能性。本研究证实“五味甘露”药液浸浴能改善缺血性脑卒中大鼠的记忆功能障碍，可上调大鼠海马组织中VEGF、BDNF的表达，为发现血管内皮细胞生长因子直接参与认知功能的发生发展、脑源性神经营养因子减轻海马损害提供了进一步的依据。

本研究采用了分子生物学和行为学方法，选取两种工艺制取的藏药浴基础方药液，观察了对大鼠认知功能障碍的改善情况，明确了藏药浴疗法对缺血性卒中的有效性，进一步证实了传统发酵工艺的优势，初步探索了药液浸浴改善认知障碍的生物学依据，为藏药浴临床研究和推广提供了科学依据。结合另一项基于403例脑卒中患者的藏药浴卫生经济学评价所证实的成本优势[8]，本研究也同时展示了藏药浴在低成本改善脑血管认知障碍、降低血管性痴呆发生率方面具有广阔的应用前景。