非小细胞肺癌化疗患者Nrf2表达与远期疗效临床分析

程治强，崔恩华，白卫云

（1.河南省直属机关第一门诊部胸外科，河南 郑州 450000；2.河南省荣军医院肿瘤科，河南 新乡453000；3.河南省第二人民医院肿瘤科，河南 新郑 451191）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NS CLC）的五年生存率较低，中位生存时间较短，远期生存预后不佳[1]。流行病学研究显示,NSCLC的发病率可达0.006%～0.012%左右,且在部分地区NSC LC的发病率呈现出一定的上升趋势[1]。在对于NS CLC发病过程中相关生物学机制的研究发现，不同生物学因子的激活可以通过提高癌细胞的增殖活性、促进其对于淋巴结的浸润而加剧病情的进展[2]。核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是协同刺激分子，其可以通过对于氧化应激反应的诱导作用,促进癌细胞的持续性扩增，导致其远处转移等的风险增加。相关研究已经证实，Nrf2的表达在促进卵巢癌、甲状腺癌等上皮细胞恶性肿瘤中发挥重要作用,认为高表达的NRF2能够促进癌细胞增殖速度的改变[3]，但对于Nrf2的表达与肺癌临床病理特征的关系研究仍鲜有报道。为了进一步揭示Nrf2在促进NSCLC发生发展中的作用，本研究通过检测Nrf2在NSCLC患者中的表达变化,并分析探讨其与患者中位生存时间的关系,以期为临床肺癌患者的预后评估提供一定的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月至2016年4月在我院接受化疗治疗的NSCLC患者87例，其中男性52例,女性35例;年龄49～71岁,平均年龄(61.20±5.43)岁；鳞癌 48例,腺癌 30例,大细胞癌 9例；Ⅲ期39例，Ⅳ期48例。纳入标准：⑴经支气管镜活检或CT穿刺肺组织后病理确诊为NSCLC；⑵符合中华医学会制定的相关标准[4]；⑶均接受含铂的双药化疗方案；⑷预计生存期＞3个月；⑸患者及家属知情同意并签署同意书。排除标准：⑴既往有恶性肿瘤史、接受过放化疗者；⑵预计生存期＜3个月。

1.2 检测方法 采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3μm，3%H2O2室温孵育 5 min，采用去离子水冲洗3次，每次3min，用浓度为1%BSA封闭液（南京碧云天生物有效公司）封闭,室温孵育 5min,加入Nrf2抗体(鼠源,南京碧云天生物科技有限公司),37℃ 孵育2h,PBS缓冲液冲洗3次,每次5min,滴加HRP标记的二抗(兔源,罗氏检测公司),37℃ 孵育30min,PBS冲洗3次,每次5min,加入NBT/BCIP色剂显色5min，复染，脱水，于透明玻片封片，镜下观察。OLIPICS光学显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。

1.3 免疫组化结果判断 在高倍镜下随机选取5个视野进行细胞计数,每个视野计数200个肿瘤细胞，染色强度分为：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞比例分为0～100%。参照陈杰[5]的免疫组化评判标准将细胞核染色强度和阳性比例乘积进行评价,乘积大于0.25为Nrf2阳性表达，小于0.25为阴性。

1.4 疗效评价 近期疗效以化疗4个周期后按照实体瘤疗效评价标准1.1版评价[6]，分为完全缓解(complete response,CR)、部分缓解(partial response,PR)、疾病稳定(stable disease,SD)和疾病进展(progressive disease,PD);远期疗效采用总生存期(overall survival,OS)评价，OS指化疗开始至死亡或随访终点时间。末次随访时间为2017年2月1日。

1.5 统计学分析 数据分析应用SPSS19.0软件进行统计分析,计数资料采用百分比或频数表示,组间比较使用χ2检验,Kaplan-Meier法进行生存曲线分析,比较采用Log-rank检验,多因素分析采用Cox回归分析,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Nrf2表达与患者临床特征的关系≥60岁患者Nrf2阳性表达率为53.19%,明显高于＜60岁患者的12.50%,Ⅳ期患者Nrf2阳性表达率为47.92%,明显高于Ⅲ期患者的17.95%（P＜0.05）；不同性别、病理类型、分化程度、化疗方案及近期疗效患者Nrf2阳性表达差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 Nrf2表达与远期疗效关系 随访期间，Nrf2表达阳性和阴性患者分别死亡18例和28例，Kaplan-Meier生存分析显示，Nrf2表达阳性患者中位OS 为 13 个月(95%CI：11.80～14.20)，Nrf2 表达阴性患者中位 OS 为 19 个月（95%CI：16.67～21.33），差异比较有统计学意义（χ2=8.460，P=0.004），见图 1。

图1 Kaplan-Meier生存曲线图

2.3 多因素分析 COX多因素分析结果显示,病理类型及Nrf2表达为NSCLC患者预后的预测因素。与肺鳞癌患者相比，腺癌患者死亡风险降低（OR=0.462，95%CI=0.183～0.953），差异具有统计学意义（P<0.05）；与Nrf2阴性患者相比，Nrf2阳性患者死亡风险升高(OR=1.806，95%CI=1.123～3.592)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 Nrf2表达与患者临床特征的关系

3 讨论

NSCLC的发生,主要与吸烟、遗传基因突变或者家族史等有关，NSCLC容易早期发生淋巴结或者血行的转移，临床预后较差[7]。临床回顾性分析研究表明，NSCLC的五年生存率不足35%，中位生存时间不足32个月[8],迄今临床上缺乏对于NSCLC患者的早期诊断或者预后的相关评估指标。本次研究通过对相关指标进行研究,为临床上NSCLC术后重点人群随访提供参考。

Nrf2是协同共刺激分子家族成员,能够通过影响癌细胞的生物学特征，进而促进癌细胞的扩散，同时Nrf2对于癌细胞对淋巴结内皮细胞浸润能力的促进作用,可加剧癌细胞淋巴结转移或者远处转移的风险[9,10]。Nrf2结构上包含了多个重复的巯基结构,能够通过与癌细胞膜表面的糖蛋白受体结合，促进癌相关基因的转录，引起细胞凋亡的抑制[11,12]。此外，临床分期越晚，Nrf2阳性表达率越高[13]。

本研究通过免疫组化分析研究Nrf2的表达与肺癌患者临床病理特征的关系,结果发现Nrf2与肺癌患者的病理类型、分化程度等临床特征并无明显的关联,提示Nrf2可能并不会影响到癌细胞的来源,同时Nrf2的表达对于肺癌上皮细胞早期分化的调控作用也可能不明显，这与贾小婷等[14]研究者在探讨部分早期肺部浸润性癌的临床免疫组化资料时报道的Nrf2表达对于癌细胞分化抑制作用并不明显结果相符。本研究中，≥60岁、Ⅳ期患者的Nrf2阳性表达率要分别明显高于＜60岁年龄段、临床TNM分期较早的患者，差异均具有统计学意义（P<0.05），提示Nrf2可以促进肺癌临床分期的进展，并可能与发病年龄具有内在的相关性。相关研究表明[15]，临床分期越晚，Nrf2的上升越为明显,这些均证实了Nrf2的表达与患者临床分期的关系。Nrf2阳性表达对于患者临床分期的影响，主要与Nrf2阳性的表达对于癌细胞的侵袭或者转移能力的改变有关[15]。在评估Nrf2对患者远期生存预后时间的影响中,本研究发现Nrf2的表达与患者的中位生存时间具有密切的关系，Nrf2的阳性率越低，中位生存时间越长，考虑可能与下列因素有关：Nrf2的阳性表达，增强了残留癌细胞的复发活性，导致癌细胞远期复发风险的增加；Nrf2的高表达,促进了肺癌细胞对于临近正常肺部组织的浸润，导致残留肺功能的降低，患者病死率或者生存时间进一步恶化。此外，COX多因素分析结果显示,病理类型及Nrf2的表达是患者OS的预测因素,进一步提示除了病理类型可以影响到肺癌患者的远期预后，Nrf2也可以有效指导评估患者的生存预后风险。但部分研究并未发现Nrf2的表达与患者生存预后的关系，考虑可能与样本量的限制、临床资料的分布偏移等有关[16]。

综上所述，Nrf2在NSCLC患者中异常表达，其表达与患者的临床分期或者年龄具有密切的关系,同时Nrf2的表达可以在一定程度上指导肺癌患者的远期临床预后。

表2 影响NSCLC患者OS的多因素Cox分析