芳香烃受体在特应性皮炎患者外周血及皮损组织中的表达及意义

胡宇晴 刘萍 慕彰磊 张建中

北京大学人民医院皮肤科 100044

特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性瘙痒性皮肤病，多见于儿童和成人，严重影响患者的生活质量，其病因和发病机制尚未完全阐明，主要与遗传、皮肤屏障破坏、微生物、免疫失调、环境和精神因素等有关［1］。芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种受配体调控的胞质转录因子，可影响多种基因的转录及表达，具有诱导多种重要的外源性细胞色素P450 酶作用，广泛存在于人体各组织细胞。近年研究表明，AhR 不仅介导各种环境毒物如多环芳烃等的毒性作用，还参与许多重要的生物学过程，如细胞增殖和分化、免疫调节、机体生长发育及生理稳态的维持。AhR 的外源性配体、可作为外来环境污染物的多环芳烃已被证实可诱发接触性皮炎、特应性皮炎、鼻炎和哮喘等变态反应性疾病［2］，推测 AhR 及其信号通路可能对 AD 的发病发挥作用。目前尚未有AhR 及其下游分子在AD 患者外周血及皮损组织中的相关研究。我们通过检测AD 患者血清、外周血单个核细胞（PBMC）及皮损中AhR 及其下游分子细胞色素P4501A（CYP1A1）、CYP1B1、芳 香 烃 受 体 抑 制 因 子（AHRR）和芳香烃受体核转位蛋白（ARNT）的表达水平，探讨其在AD发病中的作用及临床意义。

对象与方法

一、病例资料

收集2018 年8-11 月在北京大学人民医院皮肤科门诊就诊的AD 患者29 例，均符合1980 年Hanifin 和 Rajka 制定的 AD 诊断标准［3］以及 2016 年提出的特应性皮炎的“中国标准”［4］。患者均未伴发其他炎症性皮肤病（如银屑病、白癜风等）及其他免疫性疾病，2 周内未曾服用糖皮质激素或免疫抑制剂治疗。其中男18例，女11例，年龄12 ～80（43.7±18.3）岁。健康对照组17例，均为健康志愿者，其中女10 例，男 7 例，年龄19 ～ 76（39.4 ± 14.4）岁。两组受试者在年龄（t=0.522，P=0.605）和性别（χ2=1.885，P=0.170）方面差异均无统计学意义。其中27 例AD 患者由皮肤科医生进行病情严重程度评分，湿疹面积及严重程度指数（EASI）评分为18.7±15.5。取受试者外周血5 ml，其中2 ml 离心后分离血浆置于-80 ℃冰箱保存，用于细胞因子检测，3 ml经密度梯度离心获得PBMC，用于检测AhR 及其下游分子。在病例组中选取19 例AD 患者皮损组织蜡块，另选取21 例色素痣切除标本的正常皮肤组织作为正常皮肤对照进行AhR 免疫组化检测。正常皮肤组中，女8 例，男9 例，年龄（40.9 ± 10.6）岁，AD 组和正常皮肤组年龄（t= 0.533，P= 0.630）、性别（χ2=1.685，P=0.311）差异无统计学意义。本研究通过北京大学人民医院伦理委员会审批（批件号No.2018PHA033），所有受试者均签署知情同意书。

二、材料

细胞总RNA 提取试剂盒产自德国Qiagen 公司，cDNA 合成试剂盒和SYBR Green PCR 试剂盒产自北京天根生化科技有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，人白细胞介素（IL）1β、IL⁃6、TNF（肿瘤坏死因子）α、IL⁃4、IL⁃22 和 AhR 的ELISA 检测试剂盒产自美国eBioscience 公司，免疫组化试剂盒产自武汉塞维尔生物科技有限公司，兔抗人AhR 抗体产自美国Abcam 公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG产自上海碧云天生物公司。

三、方法

1.PBMC 分离：取 29 例患者及 17 例健康对照乙二胺四乙酸抗凝血3ml，加入淋巴细胞分离液，2 000 ×g离心 20 min，吸出 PBMC，加入 10 ml PBS混匀，3 000 ×g离心 10 min，弃上清液，重复洗涤3 次，弃上清，加入 600 μl RNA 提取细胞裂解液充分吹打混匀后放入-80 ℃冰箱，备用。

2.RNA提取和浓度测定：使用总RNA提取试剂盒按照操作说明书提取PBMC总RNA，测定总RNA纯度，A260/A280比值介于1.8 ～2.1之间，表示RNA纯度较好，可用于后续实验。20 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测提取的外周血总RNA的完整性，在UV1凝胶成像系统下可以观察到18S 和28S 两条条带，并且28S 的宽度约是 18S 的 1.5 ～ 2.0 倍，提示实验所提取的总RNA完整性较好，符合后续实验的要求。

3.实时 PCR（RT⁃PCR）检测 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR 和 ARNT mRNA 的 表 达 ：使 用cDNA合成试剂盒，按照操作说明冰上配制20 μl反应液，42 ℃水浴15 min，95 ℃水浴5 min，合成cDNA第1 链后迅速置于冰上，使用SYBR Green PCR 仪（美国BioRad 公司）检测 AhR、CYP1A1、AHRR 和ARNT mRNA 的表达，以β肌动蛋白为内参，引物序列参见表1。反应条件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环，不加引物或模板的扩增体系作为阴性对照。PCR 产物以20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色，用UV1 凝胶成像系统观察电泳的位置和条带情况。以2-△△Ct表示目的基因的相对表达量，ΔCt＝待检基因Ct 值-β 肌动蛋白平均Ct值。

4.ELISA 检测血清细胞因子：按照试剂盒说明书检测受试者血清IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、IL⁃4、IL⁃22和AhR水平。根据A450值，计算细胞因子浓度。

5.免疫组化检测皮肤组织中AhR蛋白表达：连续切取5 mm厚石蜡切片，二甲苯脱蜡2次，PBS洗涤3次，3%牛血清白蛋白封闭液室温封闭30 min，加入AhR抗体（1∶100）4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）室温孵育50 min，采用二氨基联苯胺（DAB）显色液进行免疫组化染色。结果判定：显微镜下观察，以角质形成细胞胞质及胞膜染成棕黄色为阳性。应用Image pro plus（IPP）显 微 图 像 分 析 系 统（University of California，USA）评估切片着色强度，获得AhR平均吸光度（A值）。

四、统计学分析

结果

一、AD组与健康对照组PBMC中AhR及其下游分子mRNA的表达

见图1。与健康对照组相比，AD 组PBMC 中AhR mRNA（1.572 ± 0.392 比 1.000 ± 0.173，t=6.819，P= 0.007）、AHRR mRNA（2.402 ± 1.716 比1.000 ± 0.788，t=3.722，P=0.039）、CYP1A1 mRNA（2.258 ± 1.598 比 1.000 ± 0.796，t= 3.400，P=0.002）均显著增高，但ARNT mRNA（1.383 ± 0.842比 1.000 ± 0.586，t= 1.653，P= 0.105）与健康对照组相比差异无统计学意义。

二、AD患者血清中AhR与细胞因子的表达

AD 组和健康对照组血清AhR 水平分别为（41.26 ± 4.52）pmol/L 和（33.73 ± 2.49）pmol/L（t=6.507，P＜0.001），AD组血清中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、IL⁃4、IL⁃22 水平分别为（49.4 ± 13.2）、（36.3 ± 7.5）、（51.5 ± 13.8）、（34.3 ± 9.2）和（19.2 ± 8.7）μg/L。

三、AD组AhR mRNA及血清水平与EASI指数的相关性

见 图2。 AD 组 PBMC 中 AhR mRNA 水 平 与EASI 评分呈正相关（r=0.448，P=0.019），但AD 组血清 AhR 水平（r= 0.135，P= 0.529）及 PBMC 中CYP1A1 mRNA（r=0.063，P=0.755）、AHRR mRNA（r= 0.033，P= 0.869）、ARNT mRNA（r= 0.119，P=0.553）水平与EASI评分均无统计学相关性。

表1 实时PCR所用引物序列

图1 特应性皮炎（AD）组（29例）与健康对照组（17例）外周血单个核细胞中AhR、CYP1A1、AHRR、ARNT mRNA 的表达 AhR：芳香烃受体；CYP1A1：细胞色素P4501A；AHRR：芳香烃受体抑制因子；ARNT：芳香烃受体核转位蛋白

图2 29 例特应性皮炎患者外周血单个核细胞中芳香烃受体（AhR）mRNA与湿疹面积及严重程度指数（EASI）相关性分析

四、AD组PBMC中AhR mRNA与血清细胞因子的相关性

应 用 Pearson 检验分 析 AD 组 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT mRNA表达与血清中细胞因子（IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α、IL⁃4、IL⁃22）的相关性，结果显示 AD 组 PBMC 中 AHRR mRNA 与血清 IL⁃1β水平呈正相关（r=0.467，P=0.021），AhR mRNA 与血清IL⁃6 水平呈正相关（r=0.377，P=0.046），AhR及其下游信号分子mRNA表达与其他血清细胞因子水平之间均无统计学相关性（均P＞0.05）。见表2。

五、AD组和正常皮肤对照组组织中AhR免疫组化结果

AD 组皮损和对照组皮肤中表皮角质形成细胞均不同程度表达AhR，AhR在正常皮肤中主要分布于表皮和真皮中上层（图3A），在AD 皮损中分布于表皮和真皮全层，并且在颗粒层染色较深（图3B、3C）。AhR 在正常皮肤中呈低中度表达（0.087±0.017），在AD 皮损中高表达（0.191± 0.041），两组AhR 吸光度差异有统计学意义（t=10.036，P＜0.001）。

讨论

AhR 又称二噁英受体，是由806 个氨基酸组成的转录因子，是细胞信号通路的调节子，其活化依赖配体的存在，属于碱性双螺旋环结构家族。在没有配体存在时，AhR 与其伴侣蛋白（热休克蛋白90和乙肝病毒X相关蛋白2）结合形成复合体，位于细胞质，处于失活状态；当配体（如多环芳香烃类、卤代芳香烃类、吲哚类及类黄酮类）存在时，伴侣蛋白从AhR解离，AhR与其激动剂结合后形成的复合体可易位到细胞核内，与ARNT 结合形成AhR/ARNT异二聚体，从而启动靶基因转录，编码外源性代谢酶，如 CYP1A1 和 IL⁃1β 等，诱导相关基因表达［5］。其中CYP1A1 可参与外环境污染物及药物代谢过程，是目前研究最多的AhR 的应答基因；AHRR 是AhR 抑制因子，也是一种负反馈转录因子。AHRR和CYP1A1产生的应答均依赖于AhR的活化［6］。

近年有研究表明，AhR 信号通路对维持皮肤屏障的完整和调节皮肤免疫具有重要作用，改变AhR信号通路产生的生物学效应不同，这取决于皮肤本身的炎症状态及配体的来源［2］。对于有炎症性疾病（如银屑病、AD、接触性皮炎和白癜风）的皮肤组织，通过配体活化AhR可抑制前炎症反应相关的转录因子如核因子（NF）⁃κB 和 IL⁃1β［6］。AhR 活化还可上调角质形成细胞内聚丝蛋白的表达，从而有利于皮肤屏障的完整性，减少外源性过敏原的刺激［7］。此外，AhR 受体激动剂如 tapinarof 已被证实可抑制前炎症细胞因子如γ 干扰素、IL⁃2 和 TNF⁃α的表达，还可抑制PBMC 向炎症反应部位的迁移和浸润，改善AD 患者的皮疹及瘙痒［8］。但还有研究表明，AhR 可介导各种皮肤疾病的发生，并且许多炎症细胞因子及其受体都具有AhR 序列的结合位点，AhR 的外源性配体如多环芳烃、二噁英和紫外线等已被多项研究证明可对皮肤组织产生多种有害的影响，如诱发皮肤肿瘤、接触性皮炎和氯痤疮等［2］。Kim 等［9］发现，银屑病患者皮损组织中 AhR mRNA 表达显著高于健康对照组，并且通过免疫组化发现银屑病皮损组织表皮中AhR 和ARNT 均有表达，且AhR 的表达高于健康对照组，但二者表皮中ARNT 的表达无显著差异。本研究在mRNA 水平上证实 AD 患者 PBMC 中 AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT 的表达均高于健康对照组，同时还发现AD 患者 PBMC 中 AhR mRNA 的表达与 AD 严重 程度呈正相关，AD患者皮损组织中AhR表达增高，提示AhR 及其信号通路很可能参与AD 的进展，并且AhR的表达水平可以作为判断AD患者病情严重程度的指标之一。AhR及其信号通路在AD中的具体作用机制尚不完全清楚，其信号通路产生的生物学效应为何不同，仍需进一步研究。

表2 29例特应性皮炎患者外周血单个核细胞中AhR、CYP1A1、AHRR和ARNT mRNA表达与部分细胞因子血清水平的相关性分析

图3 特应性皮炎（AD）患者皮损和色素痣患者正常皮肤组织中芳香烃受体（AhR）的表达（免疫组化；3A、3B：×40，3C：×200） 3A：AhR在正常皮肤组织中低度或中度表达，主要表达于表皮和真皮浅层；3B、3C：AhR在AD皮损中呈中度至重度表达，分布于表皮和真皮全层，并在颗粒层染色加深

许多炎症细胞因子及其受体、受体相关蛋白基因的增强子或者启动子区域都具有AhR结合序列，因此，AhR 能直接或间接调控炎症细胞因子的产生和分泌。一方面，AhR 各种配体能增加部分炎症因子的表达，在多种细胞系中过表达AhR可通过增强细胞NF⁃κB 和丝裂原活化蛋白激酶促进多种细胞因子如 IL⁃6、IL⁃8 和 TNF⁃α 等的产生［10］。另一方面，AhR 在生理情况下对炎症反应具有负性调控作用，通过部分途径激活AhR 可抑制前炎症反应相关的转录因子，如 γ 干扰素、IL⁃2 和 IL⁃1β。本研究显示，AhR mRNA 与 IL⁃6 呈正相关，与其他细胞因子均无相关性。Kolasa 等［11］研究表明，配体激活的 AhR 可增强 NF⁃κB 复合物的 DNA 结合活性，作用于 IL⁃6 启动子，从而增强 IL⁃6 的表达，本研究结果与既往文献一致。我们还发现，AHRR mRNA 与IL⁃1β 呈正相关，说明 AhR 的下游抑制分子可能诱导IL⁃1β分泌，然而具体机制，仍有待进一步研究。

综上，我们发现AD 患者血清、PBMC 和皮损组织中AhR 较对照组表达增高，PBMC 中AHRR 和CYP1A1 的表达显著高于健康对照组，且AD 患者PBMC 中 AhR mRNA 表达与血清 IL⁃6 水平和疾病严重程度呈正相关。本研究进一步阐明了AD的发病机制，为今后深入研究AhR 信号通路在AD 发病机制中的作用和以AhR 为作用靶点的治疗都具有非常重要的临床价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突