miR-195-5p通过PPAP2B调控肺腺癌的迁移和血管生成

李才弘，杨华军，刘长路，刘 娅，黄 婷，龚 玲，佘安俊，刘代顺,2

(1.遵义医科大学第三附属医院 呼吸与危重症医学科，贵州 遵义 563002;2.遵义市呼吸疾病研究所，贵州 遵义 563002)

肺癌(Lung cancer)是我国乃至全世界最常见的癌症之一，带来了沉重的家庭和社会负担[1]。肺癌按生物学特性主要分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)[2-4]。目前治疗肺癌的主要手段包括手术、化疗、放疗，但均存在一定的局限性，治疗效果有限。因此迫切需要寻找新的治疗方式，如今因分子生物学等学科的进步，研究肺癌发生发展的分子机制对改善肺癌患者的临床诊治及预后具有重大意义。

miRNA是长度由18～25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，具有多种生物学功能，可调节肿瘤细胞的生长、分化和凋亡，与肿瘤的发生、发展密切相关。miR-195-5p作为microRNA家族中重要的一员，在不同病理类型的恶性肿瘤中存在有促癌或抑癌的作用，例如，在子宫内膜癌[5]、前列腺癌[6]，肺癌[7]中，miR-195-5p具有抑癌作用，而在结直肠癌[8]、膀胱癌[9]中，miR-195-5p起到了促癌作用，还参与调节骨代谢影响骨密度[9]。目前研究认为，miR-195-5p是通过影响细胞对葡萄糖的摄取，调控细胞周期以及影响细胞分化来发挥作用[10]。体内实验证明，miR-195-5p的上调不仅可以通过抑制一些与细胞周期相关的基因(MYC、E2F2及其下游基因)的表达，从而阻碍细胞周期进程，还可以通过调控BCL2 、CD40等基因来实现缺血性脑卒中的神经保护作用[11]。生物信息数据库分析显示，miR-195-5p可调节多种靶基因，通过作用于不同的信号通路来调节肿瘤细胞的生物学功能。因此，研究miR-195-5p对肺腺癌的影响，可为肺腺癌的早期诊断、治疗及预后评估寻找新的分子标记物，为药物的开发带来理论基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2018年10月至2019年8月就诊于遵义医科大学第三附属医院呼吸与危重症医学科的肺腺癌患者30例为研究对象，其中男19例，女11例，平均年龄(61.3±5.1)岁，所有患者均经肺穿刺、纤维支气管镜或手术活检行病理学检查明确诊断。选取同期体检正常人30例作为对照，其中男16例，女14例，平均年龄(63.65±11.2)岁。本研究通过我院伦理委员会的审查及授权。选取的肺腺癌患者遵循以下纳入标准[12]：①病理诊断为肺腺癌；②TMN分期I期且未经过放疗或化疗；③患者及家属对研究内容知情并同意，签署研究知情同意书。排除标准：①拒绝配合者；②排除肝肾功能衰竭和神经内分泌癌等疾病患者。

1.2 材料与试剂 DMEM培养基、胎牛血清(购于贵州泰思腾生物科技有限公司)，Lipo-fectamine 3000(购于Invitrogen公司)；人肺腺癌细胞A549(购于中国科学院细胞库)，miR-195-5p模拟物(由上海生工生物工程有限公司设计合成)；qRT-PCR检测试剂盒(购于大连TaKaRa公司)，qRT-PCR所需引物(均由上海生工生物工程有限公司设计合成)；VEGF-ELISA检测试剂盒(购于北京城林生物科技有限公司)。

1.3 标本采集 真空采血管采集清晨空腹静脉血3～4 mL，室温(18～25℃)静置后，4℃，3 000 rpm离心10 min，小心转移上层血清至去酶EP管，相同条件重复离心1次，小心转移上清液至EP管，-80℃冰箱冻存。

1.4 总RNA提取 所有枪头、EP管均进行去酶处理。A549细胞用1×PBS缓冲液漂洗2～3次，每孔加入1 mL Trizol试剂，移液枪吹打均匀，冰上静置5 min，加入氯仿200 μL，漩涡振荡10 s，放冰上静置5 min，离心15 min(4℃，12 000 rpm)；吸取上层透明水相至新的1.5 mL EP管中，加入与水相同体积的异丙醇，上下颠倒混匀6～8次，放冰上静置10 min后，离心10 min(4℃，12 000 rpm)，可见管底附着白色沉淀即为总RNA；倒掉上清，加入1 mL预冷的75%乙醇，相同条件离心5 min；倒掉上清后，在超净台中吹干，加入20 μL DEPC水溶解管底的RNA沉淀；取2 μL样品于紫外分光光度计上，读取D260nm/D280nm比值，测定纯度及浓度。血清RNA的提取步骤同A549细胞。

1.5 qRT-PCR检测miR-195-5p和PPAP2B mRNA的表达 按照说明书步骤，分别用基因特异RT引物(U6 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′；miR-195-5p 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCAATAT-3′)及通用型逆转录引物oligo dT prime将500 ng总RNA反转录成cDNA。用DEPC水将反转录所得的cDNA稀释5倍，采用特异引物(U6上游引物序列为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，下游引物序列为5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3′；miR-195-5p上游引物序列为5′- GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3′，下游引物序列为5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，β-actin上游引物序列为5′-CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3′，下游引物序列为5′-CTTCGCGGGCGACGAT-3′，PPAP2B上游引物序列为5′-AGGGAGAGCGT-CGTCTTAGT-3′，下游引物序列为5′-AGGATTTGCTCAAGGAGCCC-3′)进行PCR 实验，20 μL反应体系(PCR 条件：95℃热启动3 min后，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 10 s，40 个循环)，通过2-ΔΔCT方法分析miR-195-5p和PPAP2B基因相对含量。各组 PCR 均进行3孔重复[13]。

1.6 细胞转染 将A549细胞以每孔1×105个接种于24孔板，常规培养至细胞融合度约50%，按照Lipo-fectamineTM3000转染试剂说明书分别将control NC 和miR-195-5p mimics转染至A549细胞，并标记为Control组和miR-195-5p mimics组，37℃孵育细胞48h后提取总RNA，经qRT-PCR结果显示miR-195-5p mimics组的miR-195-5p表达较对照组增高3.5倍，分析转染成功。

1.7 细胞迁移实验 取对数生长期的A549细胞，按照每孔2×104个接种于24孔的Transwell小室中，下室中加入600μL含20%胎牛血清的培养基，放入细胞培养箱中培养24 h后弃去小室中的培养基，PBS清洗两遍，用棉签轻轻擦掉小室内剩余细胞，加入甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，用清水洗3次，于显微镜下观察，随机取6个视野进行细胞计数并统计结果[13]。

1.8 ELISA检测VEGF蛋白水平 将血清/A549细胞培养液标本从-80℃冰箱中取出，常温解冻，同时从4℃冰箱中取出酶联免疫试剂盒，置于室温平衡15～30 min，严格按照 ELISA使用说明书[14]，检测受试者血清、A549细胞培养上清液中的VEGF表达[14-15]。

1.9 Western blot检测PPAP2B和VEGF水平 弃去培养基，将A549细胞用冷的PBS洗2次，用配好的细胞裂解液裂解细胞，收集蛋白液后，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，按比例加入loading buffer后煮沸，冷却后放于-20℃冰箱中保存。按每孔20 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将电泳后分离的蛋白转膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，PBST洗膜后，加入适当稀释比例的PPAP2B、VEGF和β-actin一抗，4℃反应并过夜，PBST洗膜3次，加入1∶1 000稀释的二抗，室温孵育30 min，PBST洗膜3次，加入显影液后曝光，用Image J软件分析电泳条带。

2 结果

2.1 miR-195-5p、PPAP2B及VEGF蛋白在正常人和肺腺癌患者血清中的表达 qRT-PCR结果显示，在肺腺癌血清中miR-195-5p的表达明显降低(见图1A)，而PPAP2B基因的表达明显增高(见图1B)；ELISA结果显示，VEGF蛋白在肺腺癌患者血清中表达明显增高(见图1C)。

*：与正常组相比，P<0.05。图1 正常人和肺腺癌患者血清miR-195-5p、PPAP2B mRNA的表达及ELISA检测VEGF蛋白水平

2.2 miR-195-5p成功转染A549细胞 转染miR-195-5p mimics后，A549细胞miR-195-5p的表达明显增高(见图2A)，PPAP2B的mRNA表达明显降低(见图2B)，A549细胞培养上清液中VEGF蛋白水平明显降低(见图2C)。

2.3 miR-195-5p对A549细胞迁移力的影响 转染miR-195-5p mimics后，A549细胞的迁移能力明显降低(见图3)。

*：与对照组相比，P<0.05。图2 转染miR-195-5p后miR-195-5p、PPAP2B基因及VEGF蛋白在A549细胞中的表达

A:对照组;B:miR-195-5p mimics;C:*：与正常组相比，P<0.05。图3 转染miR-195-5p对A549细胞迁移力的影响

2.4 miR-195-5p可能通过靶基因PPAP2B调控肺腺癌A549细胞的迁移及下游信号通路 通过targetscan网站预测，PPAP2B与miR-195-5p在第55-61个碱基序列上有共同的结合位点(见图4A)，而PPAP2B位于AKT的上游[16]，蛋白印迹也表明过表达miR-195-5p后，A549细胞PPAP2B蛋白表达降低，VEGF蛋白表达亦降低(见图4B、C)。

图4 miR-195-5p可能的作用靶点及信号通路

3 讨论

本实验结果显示，肺腺癌患者血清中miR-195-5p的表达比正常人低，而VEGF蛋白的表达较正常人高。转染miR-195-5p mimics后，A549细胞迁移能力明显降低，与张杨等[17]的研究结果一致。肿瘤组织的生长、转移和侵袭均依赖新生血管的形成，血管生成受多种生长因子的调控，其中VEGF是最有效的促血管生长因子[18-19]。VEGF不仅在肺癌患者的血清中表达上调，在其他类型的肿瘤如子宫内膜癌[20]、胃癌和胶质母细胞瘤[21]患者血清中，其表达也明显高于正常人，并且VEGF的升高与肿瘤的复发、转移有关，是肺腺癌的潜在分子靶点[22]。转染 miR-195-5p mimics后，VEGF的表达明显下调，分析miR-195-5p能抑制VEGF的表达而产生抗癌作用，可为肺癌进一步深入研究与临床应用提供新的切入点。

miRNAs的一般功能是通过调节靶基因的表达来发挥某种作用，因此，为进一步探索miR-195-5p影响A549细胞生物学特性的分子机制，本研究通过生物信息数据库对miR-195-5p的潜在靶点进行了预测并通过实验进行初步验证，结果显示，miR-195-5p 与 PPAP2B 在第55-61个碱基序列上有共同的结合位点 (见图4A) 。对 PPAP2B进行文献检索发现，其位于AKT上游[16]，能编码磷脂酸磷酸水解酶3(Lipid phosphate phosphohydrolase 3,LPP3)，而LPP家族是具有催化各种磷脂酸脱磷酸过程的膜蛋白，通过激活与AKT相关的信号通路来影响细胞的生物学行为，如调节细胞增殖、细胞迁移和细胞凋亡等。本研究将miR-195-5p mimics转染至A549 细胞中，通过一系列实验对miR-195-5p的功能进行了验证，结果表明miR-195-5p能调控PPAP2B的表达，对A549细胞迁移、血管生成有明显的抑制作用，但是具体的分子机制和涉及的信号通路仍需后续实验进行探索。

本实验由于临床样本量少，仅通过PCR实验从基因水平了解miR-195-5p在肺腺癌患者血清中的表达情况，从生物信息数据库分析miR-195-5p与PPAP2B的结合位点，通过PCR及WB验证PPAP2B对VEGF的调控，初步探讨了miR-195-5p可能通过调控PPAP2B，影响下游的AKT/HIF-1a信号途径[23]，进而抑制肺腺癌细胞迁移和血管新生，对肺腺癌防治靶点的选择提供新的思路。