消解-GFAAS法检测肿瘤患者用药后血清中总铂的方法研究

张浴玲，郭岱年，陈晨，方翎

(1.汕头大学医学院环境医学与发育毒理学实验室，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院附属肿瘤医院静脉用药调配中心，广东 汕头 515041)

含铂药物作为重要的抗肿瘤药物，广泛应用于临床各种肿瘤的治疗[1]。铂类药物作为传统的抗肿瘤药物，其疗效明显，却也被报道了不少不良反应，如过敏、瘙痒等免疫系统症状及恶心、呕吐等胃肠道症状[2-3]，目前国内大部分研究聚焦于某一种铂类药物引起的不良反应，对用药后某种铂类药物的血药浓度进行检测报道的占大多数，却未曾探索所有铂类药物共有的不良反应，是否与铂作为重金属元素的蓄积相关。有报道指出，从呼吸道吸入的铂，可能引起免疫球蛋白介导的Ⅰ型过敏反应[4]，国外有报道指出，即使是在结束化疗5～10年后，患者体内铂的蓄积仍然与神经毒性相关[5]。针对目前关于总铂的测量与研究较少，且方法不一，大部分方法较烦琐，需要复杂的消化过程[6]、使用基体改进剂[7-8]或使用运行成本较高的仪器等情况[9]，本研究旨在通过使用石墨炉原子吸收分光光度仪，探索适合血清中总铂含量测定的前处理方法及仪器条件，为用药后体内铂总量测定提供经济、便捷、有效的方法依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 仪器：GFAAS-650 石墨炉原子吸收分光光度仪(德国耶拿)；APE-60自动进样器；移液器(0～1 000 μL、0～200 μL，德国艾本德)；铂空心阴极灯(中国北京有色金属及电子材料分析测试中心)。

试剂：硝酸(65%，优级纯，美国默克)；Triton X-100(Solarbio Life Science)；铂标准液(1 000 μg·mL-1,北京有色金属及电子材料分析测试中心)；高纯氩气(汕头市第一气体厂)。

1.2 标准品及样本配制 空白液：0.5%硝酸溶液。

标准储备液：用空白液对铂标准液进行稀释至终浓度为100 μg·L-1的标准储备液。

基体改进剂：用空白液对Triton X-100进行稀释并调整自动进样器的进样量，使其最终浓度为0.25%。

样品溶液配制：经医师评估需使用顺铂或奥沙利铂进行化疗的患者，注射顺铂或奥沙利铂后第4天(确保药物在体内经过了至少1个半衰期)，抽取患者静脉血1 mL，以3 500 rpm的转速离心获得血清约0.5 mL，分别吸取使用奥沙利铂及顺铂患者的血清100 μL混合，以0.5% 硝酸溶液稀释至1 mL，上机待测。

1.3 工作条件 工作条件设定：波长为265.9 nm，狭缝宽度为0.2 nm，灯电流8 mA，塞曼效应扣背景，2-磁场，最大强度0.9 T，进样体积20 μL，峰面积定量，保护气：氩气99.999%；进样深度-0.60 mm，标准储备液浓度100 μg·L-1，测量次数为2次。

石墨炉温度程序的设定：为了探索适合血清铂检测的工作条件，对石墨炉升温程序进行了调试，分别尝试了厂家推荐的条件-温度程序1、调整的条件2-温度程序2、调整的条件3-温度程序3。

是否需要加基体改进剂的测定：在获得适宜温度程序之后，对样本检测是否需要加入基体改进剂进行对比。

2 结果

2.1 石墨炉温度程序的检测结果比较 通过厂家推荐的温度程序(见表1)检测样品或标样(浓度为25 ppb)都没有明显的吸收峰(见图1～2)，将标样浓度加大至100 ppb时，得图3，峰型较差。说明在该温度条件下，铂的灵敏度不够，不足以将铂释放并很好地转化为基态原子，因此通过改进灰化和原子化温度进行调节。

表1 温度程序1

图1 条件1检测样品吸收峰图

图2 条件1检测标样(25 ppb)吸收峰图

图3 条件1检测标样(100 ppb)吸收峰图

尝试条件2(见表2)，将原子化温度升至2 600 ℃，全速率升温，与图3相比，可得吸收峰，但峰型(见图4)不理想。

表2 温度程序2

图4 条件2检测标样吸收峰图(100 ppb)

尝试温度程序3(见表3)，原子化温度升至2 700 ℃，并以较缓慢的速率(700 ℃·s-1)上升，灰化温度调整为1 150 ℃，可得样品及加标的吸收峰，峰型理想(见图5～6)，背景对待测元素峰型干扰不大，两次样品检测RSD为0.53%，两次样品加标检测的RSD为0.62%，在温度程序3的基础上，将原子化温度升高至2 750 ℃，发现2 750 ℃时同一样品吸光度为0.092 6(见图7)，而2 700 ℃吸光度为0.092 70(见图5)，认为2 700的原子化温度更适合。以条件3拟合曲线(见图8)，得拟合度0.990 1。

表3 温度程序3

图5 条件3检测样品吸收峰图

图6 条件3检测样品加标(35 ppb)吸收峰图

图7 条件3-原子化2 750 ℃的样品吸收峰图

图8 条件3-标准曲线

在温度程序3的条件下，采用加标回收率法检测回收率，所得回收率均值为94.77%(见表4)。

表4 加标回收率结果

检测限：对空白溶液进行11次检测，获得吸光度的均值为0.002 2，换算出浓度的检测限为31.16 μg·L-1。

2.2 是否加基体改进剂的检测结果比较 采用温度程序3，加用基体改进剂(0.25% Triton-100 溶液)，测试样本吸光度为 0.086 27，低于未加基体改进剂样本的吸光度(0.092 70)(见图9～10)。

图9 加基改的样品吸收峰图

图10 未加基改的样品吸收峰图

3 讨论

3.1 总铂的测定方法 顺铂、奥沙利铂等铂类药物进入体内后，90%与血浆蛋白结合[10]，经过一系列代谢过程后，部分以游离状态存在于血液中，一般高效液相色谱法或近年来开展的荧光探针法[11]，都只能检测结合型铂的含量，如顺铂或奥沙利铂的血药浓度，难以测定铂元素含量。本研究采用石墨炉原子吸收法，前处理过程使用硝酸，具有强氧化性，可溶解大多数有机物和金属，消化血液成分中的蛋白质等杂质，在高温条件(灰化温度大约在1 000 ℃左右)下，可以使有机物和大部分无机盐气化，减少共存物对待测元素的干扰，然后在超高温度(原子化温度达2 700 ℃)的条件下，使待测元素铂原子化，再以特征波长的光照射，从而检定光的吸收量(吸光度)而获得样本总铂量。对比其他使用原子吸收检测铂的方法，大部分研究采用的是血浆样本[10,12-14]，可能造成检测结果偏于结合型铂(即与血浆蛋白结合的原形药)的水平，而非铂元素含量。近年来越来越多的研究采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)检测血清中的铂元素,与AAS相比，ICP-AES/MS能同时高通量检测多种元素，工作效率优于AAS，但ICP-AES/MS条件摸索较难，尤其是同一样本溶液中各元素含量差异过大时，难以调试出适合不同金属检出限的方法。从仪器的灵敏度来看，ICP-MS的检出限最优，大部分元素为ppt级；GFAAS次之，检出限为亚ppb级；ICP-AES一般为1～10 ppb。从运营成本来看，ICP-AES/MS使用的成本远高于GFAAS，仅高纯氩气而言，ICP-MS的氩气使用量为20 L·min-1(分析状态)，即每一瓶常规高纯氩气可以检测75例样本，而使用GFAAS则每瓶氩气可检测300例样本。另外，ICP-AES/MS运行还需使用高纯氦气及氢气，配件维护及更换的成本也远高于GFAAS。因此，如果不是进行高通量或超痕量分析，从经济成本和使用仪器的便捷性来看，选择GFAAS更适合。本研究所使用的GFAAS，国内大部分医疗卫生或科研机构具备，研究获得检测血清中总铂含量的方法，可为这些机构提供参考。

3.2 各个阶段温度对检测结果的影响 石墨炉4个升温程序及其主要作用如下：①干燥：蒸发除去样本的溶剂，如水分或各种酸溶液；②灰化：破坏并除去样本中的基体，尽量将共存组分和待测元素分开，减少共存物和背景吸收的干扰,灰化温度一般在1 000 ℃左右，可以除去大部分的有机物；③原子化：将待测元素转化为基态原子，供吸收测定；④除残：净化除去残渣，消除石墨管记忆效应。

每个阶段的温度和持续时间都可能对检测结果产生影响，本研究首先采用仪器推荐的条件，发现出峰不明显，将标准品浓度提高至100 ppb时，才稍有出峰，但峰型结果显示，出峰不完整，系原子化温度太低，铂原子原子化不足所致，因此调整原子化至2 600 ℃，获得较好的出峰情况，但峰型呈锯齿状，提示原子化仍然不足。再将灰化温度提高至1 150 ℃，原子化温度提高至2 700 ℃，速率设为700 ℃·min-1，获得明显改善的峰型。原子化温度是检测样本的关键，直接关系到目标元素是否充分原子化，但过高的原子化温度会过度损耗石墨管和石墨炉腔体，因此要在能获得目标元素最高检测结果的情况下选择最低的原子化温度,本研究采用了获得最高吸光度值及平滑完整峰型的温度条件(原子化温度2 700 ℃)。选择了该温度条件后，通过加标回收率评估了该条件的适用性，并通过检出限试验，获得31.16 μg·L-1的铂检出限值，灵敏度高于其他研究[15]。因此，本研究温度条件适合该仪器进行血清总铂的测量。

3.3 基改的优点与缺点 本研究所试用基体改进剂为Triton X-100，是一种非离子表面活性剂，用于消除基质干扰,然而有研究指出,Triton X-100对石墨管损伤较大，目前的报道对是否需使用基体改进剂说法不一[16]，本研究通过对比是否加入Triton X-100的两种检测结果，发现加入Triton X-100的样本吸收峰值与干扰背景峰值同时降低，而未加入Triton X-100的样本能够获得最大吸收值，检测回收率及偏差也在允许范围内。因此本研究认为，血清中的铂含量测定，前处理过程无须加入基体改进剂。

综上，本研究中血清前处理方法及石墨炉检测温度程序适用于GFAAS-650对总铂的浓度测定，且本方法简单易行，灵敏度高，相对标准偏差及经济成本较低，适合国内使用石墨炉原子吸收分光光度仪检测肿瘤患者总铂含量的机构。