单囊胚冻融移植周期中囊胚质量对妊娠结局和新生儿结局的影响

郭 娜 远孝琼 尧阳城 邓陶然 杜瑶瑶 腾雪梅 李豫峰

(华中科技大学同济医学院附属同济医院生殖中心，湖北省武汉市 430000，电子邮箱：tsguona@126.com)

近年来，随着社会压力增大、环境污染加剧、妇女生育年龄推迟以及二胎政策放开，不孕症患病率逐年上升[1-2]。高龄、卵巢功能减退的不孕患者越来越多[3]，其临床表现为卵巢刺激反应不佳，获卵数少，卵母细胞质量差，可供移植胚胎数量及质量下降[3-4]。大多数女性会对移植非优质胚胎的母婴结局感到焦虑，临床医生也可能会对移植非优质胚胎犹豫不决。人类辅助生殖技术的理想结局是单胎健康活产。胚胎质量是决定体外受精-胚胎移植成功率的主要预测指标。目前，很少有研究关注胚胎质量与妊娠结局、新生儿结局的相关性。本研究通过回顾性分析2 593个单囊胚冻融移植周期的临床资料，以评估胚胎质量对妊娠结局及新生儿结局的影响，为改进胚胎选择策略及提高单囊胚冻融周期移植成功率提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2012年1月至2016年12月在我院接受单囊胚冻融移植的2 593个周期的临床资料。纳入标准：(1)夫妻双方染色体核型正常；(2)单囊胚移植周期；(3)女方宫腔形态正常，无子宫畸形、宫腔粘连、子宫多发性内膜息肉、子宫内膜炎、子宫内膜结核，无不良孕产史及反复流产病史。排除标准：夫妻双方任一方存在甲状腺疾病、糖尿病、高血压等代谢性疾病史。本研究进行单囊胚移植周期的原因如下：(1)新鲜周期移植后仅剩1个符合冷冻标准的囊胚用于冷冻保存；(2)囊胚由于冷冻损伤，复苏后仅剩1个存活囊胚可供移植；(3)瘢痕子宫或避免多胎妊娠，复苏周期患者仅要求移植1个存活囊胚。采用Gardner囊胚评分体系[5]评估囊胚质量，根据囊胚质量不同分为优质囊胚组1 727个和非优质囊胚组866个。两组的女方年龄、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、体质指数、子宫内膜厚度、不孕年限及类型、不孕病因及内膜方案比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。本研究通过本院医学伦理委员会批准，所有患者夫妻双方均了解并知情同意。

表1 两组间基础资料的比较

1.2 囊胚培养及评估 采用常规体外受精、卵胞浆内单精子显微注射技术 (intracytoplasmic sperm injection,ICSI)进行受精，16～18 h后进行观察，根据胚胎卵裂情况，于体外受精后第3天挑选1～2个卵裂期胚胎用于新鲜周期移植或冷冻，剩下的胚胎转移至G2囊胚培养液中继续培养2～3 d，将达到冷冻标准的囊胚进行玻璃化冷冻保存。于体外培养第5、6天对囊胚形态进行评估，按照Gardner囊胚评分体系[5]根据囊腔扩张程度对囊胚进行分期：囊腔范围小于胚胎体积的一半为1期；囊腔范围超过胚胎体积的一半为2期；囊腔占满整个胚胎为3期；囊腔完全扩张，透明带变薄为4期； 囊胚开始孵化为5期；囊胚完全孵出为6期。3期及以上的囊胚，则进一步对囊胚内细胞团(inner cell mass，ICM)和滋养外胚层(trophectoderm，TE)进行评级。ICM评级标准[5]：A级为ICM细胞数多，紧密成团，清晰可见；B级为ICM细胞数少，排列松散；C级为ICM细胞数极少，几乎没有，不清晰。TE评级标准[5]：A级为TE细胞数多，呈镰刀形连续平铺；B级为TE细胞数少，排列松散；C级为TE细胞数极少，几乎没有，不清晰。冷冻标准：于囊胚培养第5、6天观察囊胚形态，若囊胚在3期及以上，且ICM或TE评级在B级以上，其中3BB及以上的囊胚为优质囊胚，而AC/BC/CA/CB囊胚为非优质囊胚。

1.3 囊胚冷冻及复苏程序 本研究所用冷冻液、载杆、复苏液均购自日本KITAZATO生物制药有限公司。按照本中心常规步骤进行囊胚冷冻复苏[6]。复苏后的囊胚均置入37℃的COOK桌面培养箱培养，2 h后观察囊胚色泽及囊胚腔是否重新扩张，囊腔部分或全部扩张为存活，进行移植。

1.4 内膜准备方法 (1)自然周期：于患者月经周期第10～12天采用B超监测卵泡及内膜，排卵当日查血黄体生成素、雌二醇、孕激素水平，于排卵后4～5 d进行冻融囊胚移植。(2)人工周期：按递增法口服戊酸雌二醇(补佳乐，德国拜耳制药)，服用方法为月经第2～4天2 mg/d(1次/d),第5～8天2 mg/d(2次/d),第9～12天3 mg/d(2次/d),根据内膜厚度调整用药量及时间。当内膜厚度达到7 mm及以上且雌激素作用时间不少于10 d时，给予黄体酮转化内膜，在转化的第6天进行囊胚解冻。

1.5 移植后的支持治疗 黄体支持方案有两种：(1)黄体酮阴道缓释凝胶(默克雪兰诺公司，规格：90 mg/支)，90 mg/次，1次/d，置于阴道；并口服地屈孕酮(苏威制药厂，规格：10 mg/片)，10 mg/次，2次/d。移植后继续给药至12 d验血。(2)黄体酮软胶囊(法国法杏大药厂，规格：100 mg/粒)，200 mg/次，1次/d，置于阴道；并口服地屈孕酮，20 mg/次，2次/d。移植后继续给药至12 d验血。

1.6 妊娠及新生儿结局的评估 (1)着床：囊胚移植4～6周行阴道B超可见到孕囊数目。着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%。(2)临床妊娠：囊胚移植后12 d查血β人绒毛膜促性腺激素阳性，且移植后4～6周行阴道B超可见孕囊，包括宫外孕。临床妊娠率=临床妊娠周期数/总移植周期数×100%。(3)早期流产：妊娠后于12周前终止为早期流产。早期流产率=早期流产周期数/总移植周期数×100%。(4)异位妊娠：囊胚在子宫腔以外着床。异位妊娠率=异位妊娠周期数/总移植周期数×100%。(5)活产：胎儿娩出后至少具有以下一项生命体征，包括心跳、呼吸、脐带搏动、随意肌收缩。活产率=活产周期数/总移植周期数×100%。(6)多胎妊娠：移植后早孕期B超见到2个及以上的孕囊。多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/总移植周期数×100%。(7)引产：因发现胎儿畸形、母亲严重妊娠并发症而不能继续妊娠或其他原因(不包括死胎)人为终止妊娠。引产率=引产周期数/总移植周期数×100%。(8)母体并发症：主要包括妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、胎膜早破、前置胎盘等。(9)低出生体重儿：出生体重小于2 500 g。(8)极低出生体重儿：出生体重小于1 500 g。(10)巨大儿：出生体重大于4 000 g。(11)早产：活产周期中，满20周至37周前分娩。(12)出生缺陷：在出生时或出生以后表现的结构、功能或发育异常，可能是由出生前遗传或非遗传因素造成。(13)围生期死亡儿：死产及胎儿娩出后早期新生儿死亡。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以[M(P25，P75)]计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组的妊娠结局比较 优质囊胚组有1 288个(74.58%)常规体外受精周期和439个(25.42%)ICSI周期，非优质囊胚组有604个(69.75%)常规体外受精周期和262个(30.25%)ICSI周期，优质囊胚组常规体外受精比例高于非优质囊胚组，ICSI比例低于非优质囊胚组(χ2=6.833，P=0.009)。优质囊胚组着床率、临床妊娠率、活产率均高于非优质囊胚组(均P<0.05)，而两组间异位妊娠率、早期流产率、多胎妊娠率、引产率及母体并发症发生率比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。优质囊胚组共9个周期引产，其中4例因胎儿畸形(肾脏畸形1例、脊柱畸形1例、心脏畸形1例、唇腭裂1例)引产，2例因染色体异常引产，另外3例因孕中期胎死宫内而引产；非优质囊胚组共4个周期引产， 其中2例因胎儿畸形(唇腭裂1例，脑部结构发育异常1例)引产，1例胎膜早破而引产，1例重度子痫而引产。

表2 两组间妊娠结局的比较[n(%)]

注：优质囊胚组的27个多胎妊娠周期中，中途流产15个，最终只有12个双胎活产周期；非优质囊胚组的6个多胎妊娠周期均在中途流产。

2.2 两组新生儿一般情况及结局比较 优质囊胚组有12个双胎妊娠活产周期(其中8个为男性双胎，4个为女性双胎)，非优质囊胚组无双胎活产周期。本研究仅比较两组间单胎妊娠的新生儿结局。优质囊胚组男性新生儿比例高于非优质囊胚组(P<0.05)，两组间新生儿分娩方式、出生时孕周、出生体重以及早产儿比例、低出生体重儿比例、极低出生体重儿比例、巨大儿比例、围生期死亡儿比例、出生缺陷发生率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。优质囊胚组单胎妊娠新生儿有3例出生缺陷，包括心脏发育不良1例、女婴卵巢囊肿1例、软腭裂1例；非优质囊胚组单胎妊娠新生儿有2例出生缺陷，包括Turner综合征1例、左心室未闭合1例。

表3 两组单胎妊娠新生儿一般情况及结局的比较

3 讨 论

目前，在世界范围内每6对夫妻中就有一对受到不孕症的影响，这影响了家庭稳定及社会和谐。自1978年世界上第1例试管婴儿诞生以来，人类辅助生殖技术获得了突飞猛进的发展，给许多不孕症患者家庭带来了福音。但是，伴随着床率提高的同时，医源性多胎妊娠已经成为人类辅助生殖技术最常见的并发症之一。单胚胎移植被认为是减少多胎妊娠的最佳方法，而胚胎质量则是影响单胚胎移植成功率的主要因素。有学者认为胚胎质量与着床率、临床妊娠率相关[7]，而其与产科结局和新生儿结局的关系却尚不清楚。移植不同质量的胚胎对母婴结局的影响，成为生殖专家及不孕症患者们共同关注的问题。

成功的人类辅助生殖技术妊娠依赖于良好的子宫内膜容受性，同时选择优质胚胎进行移植也是影响其结果的重要因素。有研究表明，移植质量较差的胚胎可能会降低临床妊娠率和活产率[8]，这可能是因为质量较差的胚胎具有较高的非整倍体率[9]。本研究通过设置严格的纳入、排除标准，排除了移植胚胎个数和子宫内膜容受性等因素，采用冻融周期单囊胚移植模型来研究胚胎质量对母体和子代的影响，结果显示优质囊胚组的临床妊娠率及活产率高于非优质囊胚组(P<0.05)。这可能与受精方式的不同影响了妊娠结局有关：与非优质囊胚组比较，优质囊胚组常规体外受精的比例更高，而ICSI的比例更低(P<0.05)。既往研究表明，ICSI虽然可以改善获卵数少的患者的受精率，但并不能提高胚胎利用率、优质胚胎率[10]。与常规体外受精过程相比，ICSI将单个精子直接注射到卵母细胞内，可能增加了对卵母细胞结构的损伤，同时绕过了卵母细胞对精子自然选择的屏障，使质量差的精子受精，从而影响了胚胎质量和妊娠结局。有学者认为，选择形态学评分较差的胚胎进行移植，一旦达到临床妊娠，大多数都可获得活产，这对于反复出现胚胎发育较差的女性而言是不错的选择[11]。而在本研究中，移植质量较差的囊胚也能获得33.6%的活产率。

目前，有关胚胎质量对新生儿结局影响的研究报道较少。有学者认为，胚胎质量对母体及子代健康的影响不应忽略不孕因素本身会增加围生期风险，比如早产、低出生体重儿、子痫前期、胎膜早破等，其中卵巢早衰可能会增加母体并发症发生率[7]。而本研究中，不同质量胚胎组在母体并发症发生率、分娩方式、孕周、出生体重、早产儿比例、低出生体重儿比例、极低出生体重儿比例、巨大儿比例、出生缺陷发生率等方面差异并无统计学意义(P>0.05)。Oron等[7]在研究1541例新鲜单胚胎移植周期临床结局时发现，移植质量较差的胚胎并未增加围生期和新生儿不良结局的发生率。Nakagawa等[11]在评估移植胚胎质量与最终围产结局关系时发现，移植质量较差的胚胎达到临床妊娠的可能性虽然低于移植优质胚胎，但一旦达到临床妊娠，其获得活产的概率以及围生期结局与移植优质胚胎者相似，这一研究结果为只能选择劣质胚胎进行移植的患者提供了良好的心理安慰和有力的数据支撑。本研究结果与上述研究结果类似，然而局限于本研究的实验设计和样本量，所得结论需要样本量更大的前瞻性研究加以验证。此外本研究中，优质囊胚组男性新生儿比例高于非优质囊胚组(P<0.05)，这可能与非优质囊胚组ICSI比例更高有关，行ICSI治疗的夫妇多为男性不育，其含Y染色体精子的受精能力下降，或含X染色体的精子比含Y染色体的精子更容易优先获得[12]。Huang等[13]利用Timelapse延时摄像系统观察胚胎发育动力学参数与活产胎儿性别之间关系，发现男胚比女胚生长速度快，当胚胎冷冻复苏时，优质男胚更容易被选中移植。

综上所述，单囊胚冻融移植周期中，囊胚质量虽然会影响母体妊娠率和活产率，但移植质量较差的囊胚并不会增加围生期不良结局和新生儿缺陷的发生率。选择质量差的胚胎进行移植对于反复出现胚胎发育较差的女性而言会是不错的选择。