冻融囊胚的发育天数和质量对妊娠结局的影响

柴娟 余柯达 包云 师帅 邹立波

近年来辅助生殖技术中的胚胎培养体系和胚胎环境变得更完善，胚胎种植率得到了显著提高，使多胎妊娠率成为了辅助生殖技术中的一个严重并发症，其可诱发流产、贫血、早产、妊娠高血压综合征和前置胎盘等妊娠并发症。因此在不降低临床妊娠率的前提下，如何减少多胎妊娠率成为国内外研究的重点。目前部分生殖医学中心采用单囊胚移植来替代双卵裂期胚胎移植，以实现单胎妊娠的体外受精/卵胞浆内单精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）理想结局[1]，且研究结果表明单囊胚移植不会使临床妊娠率和活产率降低[2-4]。但上述研究中所移植的囊胚均为优质囊胚，未见细分不同发育天数及质量的囊胚移植数目对妊娠结局影响的报道。本研究根据冻融囊胚的发育天数分别进行分析，并根据囊胚的质量决定移植数目，以探讨第5日（D5）和第6日（D6）不同质量的囊胚移植数目对妊娠结局的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年8月至2020年1月在金华市人民医院生殖医学中心行冻融囊胚移植者的1 425个周期，所有囊胚采用玻璃化冷冻复苏法进行冷冻、复苏。纳入标准：（1）患者年龄＜40 岁；（2）无子宫畸形、合并子宫肌瘤和子宫腺肌病等；（3）无习惯性流产史；（4）无遗传性及家族性病史。冻融囊胚移植周期根据囊胚形成时间分为D5组874个周期与D6组551个周期，再根据移植囊胚质量和个数将D5/D6组分为单优质囊胚移植组、优质囊胚+非优质囊胚移植组和双非优质囊胚移植组。本研究经医院医学伦理委员会审查通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 囊胚培养与评分 患者均采用常规长方案行促排卵治疗，取卵日为第 0日（D0），行IVF/ICSI，于第 1日（D1）观察受精情况，双原核为正常受精，胚胎培养采用瑞典Vitrolife序贯培养基培养，于D5和D6观察囊胚形成情况及形态。囊胚评分采用Gardner评分标准[5]，将D5评分在3BB及以上的囊胚定为优质囊胚，3CC以上除去优质囊胚的囊胚定为非优质囊胚；或D6在4BB及以上的囊胚定为优质囊胚，4CC以上除去优质囊胚的囊胚定为非优质囊胚。

1.3 囊胚玻璃化冷冻与复苏 囊胚采用玻璃化冷冻液（日本加藤公司）进行冷冻保存，冷冻前进行激光破膜，完全皱缩后将其放入平衡液（ES）中平衡10 min,随后放入玻璃化冷冻液（VS）中，60 s内将囊胚转移至冷冻载体Cryotop（日本加藤公司）上，迅速投入液氮中保存。囊胚复苏采用玻璃化解冻液（日本加藤公司），将Cryotop从液氮中取出后迅速放入解冻液（TS，预热至37℃）中1 min，然后依次将囊胚移至稀释液（DS）、洗涤液 1 和洗涤液 2（WS1、WS2）中各 3、5 和 1 min，最后放入G-2 PLUS（瑞典Vitrolife公司）中培养，复苏后2 h观察囊胚的存活情况。

1.4 冻融囊胚移植 所有患者均采用人工周期进行内膜准备，即从月经的第3天口服补佳乐6 mg/d（德国Bayer公司，1 mg/片），或从月经的第3天口服芬吗通（红片）6 mg/d（美国雅培公司，2 mg/片），连用两周后行B超检查及雌二醇、孕酮测定，根据患者情况，加用黄体酮针（浙江仙琚制药股份有限公司）80 mg/d肌肉注射进行内膜转化，于第5天行囊胚移植。移植后4周进行B超检查，子宫腔内见孕囊及原始心管搏动为临床妊娠。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义；计数资料组间比较采用χ2检验，两两比较采用Bonferroni法校正检验水平，以 P＜0.05/n（n=3，P＜0.0167）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D5组和D6组冻融囊胚移植的妊娠结局比较 D5组和D6组年龄、BMI、不孕年限、基础促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、内膜厚度、移植胚胎数、异位妊娠率和多胎妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；D5组种植率和临床妊娠率均高于D6组，且早期流产率低于D6组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

2.2 D5囊胚移植对妊娠结局的影响 不同移植囊胚质量和个数3组患者年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、内膜厚度和异位妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但种植率、临床妊娠率、早期流产率和多胎妊娠率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两两比较发现，单优质囊胚移植组种植率高于优质囊胚+非优质囊胚移植组和双非优质囊胚移植组（均P＜0.0167），优质囊胚+非优质囊胚移植组种植率高于双非优质囊胚移植组（P＜0.0167）；优质囊胚+非优质囊胚移植组临床妊娠率高于单优质囊胚移植组（P＜0.0167）；双非优质囊胚移植组早期流产率高于单优质囊胚移植组（P＜0.0167）；不同移植囊胚质量和个数3组多胎妊娠率的变化趋势与种植率相反，单优质囊胚移植组最低，双非优质囊胚移植组次之，优质囊胚+非优质囊胚移植组最高（均 P＜0.0167），见表 2。

2.3 D6囊胚移植对妊娠结局的影响 不同移植囊胚质量和个数3组患者年龄、BMI、不孕年限、基础FSH、内膜厚度和异位妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），但种植率、临床妊娠率、早期流产率和多胎妊娠率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两两比较发现，单优质囊胚移植组和优质囊胚+非优质囊胚移植组种植率均高于双非优质囊胚移植组（均P＜0.0167）；优质囊胚+非优质囊胚移植组临床妊娠率高于单优质囊胚移植组，但多胎妊娠率也高于单优质囊胚移植组（均P＜0.0167）；单优质囊胚移植组和优质囊胚+非优质囊胚移植组早期流产率均低于双非优质囊胚移植组（均 P＜0.0167），见表 3。

3 讨论

随着囊胚玻璃化冷冻与复苏技术的不断改进，其复苏率、种植率和临床妊娠率等得到了极大的提升。囊胚玻璃化冷冻与复苏已成为辅助生殖技术中不可或缺的技术手段，其不仅可提高累计临床妊娠率，还可降低多胎妊娠及卵巢过度刺激的风险。在囊胚新鲜移植周期中，D5囊胚的种植率和临床妊娠率显著高于D6囊胚[6]。本研究冻融移植周期结果也表明D5冻融囊胚移植后的种植率和临床妊娠率均高于D6冻融囊胚，流产率低于D6冻融囊胚，且多胎妊娠率与D6冻融囊胚比较差异无统计学意义，与李诚等[7]的研究结果一致。Elgindy等[8]还发现D5囊胚在解冻移植周期的D5或D6进行移植，临床妊娠率不会改变，但D6囊胚的临床妊娠率显著下降。发育迟缓的囊胚比正常发育的囊胚临床妊娠率低，原因可能与D6囊胚中的异常纺锤体的发生率显著高于D5囊胚有关，导致D6囊胚具有较高的非整倍体率[9]。Kadar等[10]也认为D6囊胚与D5囊胚相比，D6囊胚的细胞DNA损伤更多，且发育速度较D5囊胚有所延迟，因此在胚胎质量上会稍差于D5囊胚，所以导致相同质量下D6囊胚的种植率低于D5囊胚。因此建议IVF/ICSI周期中优先移植D5囊胚。

表1 D5组和D6组冻融囊胚移植的妊娠结局比较

表2 D5囊胚移植对妊娠结局的影响

表3 D6囊胚移植对妊娠结局的影响

为了降低多胎妊娠的风险，囊胚培养和单囊胚移植成为了国内外各大生殖医学中心的首选技术[1]。囊胚培养后胚胎的非整倍体率进一步降低[11]，且囊胚移植可改善子宫和胚胎的同步性，从而提高种植率[12]。然而，在决定要移植囊胚个数前，有许多因素会对临床妊娠率产生影响，囊胚质量是其中的关键因素。囊腔扩张程度、内细胞团（inner cell mass，ICM）和滋养层细胞（trophectoderm，TE）等囊胚质量相关指标与新鲜/冷冻囊胚移植后的种植率和活产率有关[13-14]。鉴于囊胚形态学与活产率之间的相关性，根据Gardner评分，玻璃化冷冻并进行复苏移植的通常仅限于囊腔扩张程度评分为3～5期的囊胚，以及ICM/TE的最低等级为B，即优质囊胚[5]。在IVF/ICSI周期中，并非所有周期都能获得优质囊胚，尤其是高龄或卵巢低反应患者，对于这些患者移植非优质囊胚是否可以得到临床妊娠是非常重要的。然而，关于玻璃化冷冻后非优质囊胚着床潜能的现有数据非常有限。

本研究探讨了不同质量冻融D5/D6囊胚移植数目对妊娠结局的影响。冻融D5囊胚移植后妊娠结局如下，3组种植率/临床妊娠率分别高达54.63%/54.63%、42.08%/68.61%和35.60%/64.40%，均高于本中心移植双D3优质胚胎的种植率/临床妊娠率[15]。双非优质囊胚移植组早期流产率高于单优质囊胚移植组和优质囊胚+非优质囊胚移植组。3组多胎妊娠率分别为0.89%、22.67%和10.55%，优质囊胚+非优质囊胚移植组高于单优质囊胚移植组和双非优质囊胚移植组。这一结果显示，移植单优质D5囊胚在保证较高种植率的条件下，可减少多胎妊娠的风险，与Mullin等[4]研究结果一致。非优质D5囊胚则考虑行双胚胎移植，较高的临床妊娠率，可以抵消部分早期流产率高的影响，保证其有较高的活产率，且其多胎妊娠率较低。冻融D6囊胚移植后，3组临床妊娠率分别为35.71%、54.10%和43.08%，优质囊胚+非优质囊胚移植组临床妊娠率高于单优质囊胚移植组；但单优质囊胚移植组种植率高达35.71%，优质囊胚+非优质囊胚移植组和双非优质囊胚移植组仅为30.94%和22.82%，单优质囊胚移植组最高；且早期流产率和多胎妊娠率单优质囊胚移植组最低。双非优质囊胚移植组种植率和早期流产率均差于单优质囊胚移植组和优质囊胚+非优质囊胚移植组。上述结果提示，移植D6囊胚的策略与D5囊胚一致，移植单优质D6囊胚具有最佳的临床结局，而非优质D6囊胚则考虑行双胚胎移植。

综上所述，D5冻融囊胚移植后的种植率和临床妊娠率显著高于D6冻融囊胚，且D5/D6非优质囊胚的种植率均显著低于优质囊胚，结果表明可以通过囊胚发育速度和囊腔扩张程度、ICM与TE等囊胚形态学相关指标预测囊胚移植后的临床妊娠结局。本研究建议IVF/ICSI周期中优先移植D5囊胚，优质囊胚行单囊胚移植，非优质囊胚则行双囊胚移植。以上移植策略可以在保证获得临床妊娠的同时，尽量减少多胎妊娠的风险。