缺氧诱导因子-1α上调Cx43表达造成星形胶质细胞损伤的作用机制研究

官俏兵 张晓玲 沈和平 俞晓翔 阮水良

近年来，星形胶质细胞在中枢神经系统中的作用得到了较多的研究[1]。在缺血缺氧性脑病的研究中发现星形胶质细胞可以通过自身炎症反应释放大量炎症因子，造成神经细胞损伤[2-3]。缺血缺氧条件下，缝隙连接蛋白（Cx43）的表达增加，且空间分布发生改变，从而调控细胞通道蛋白表达，介导物质交换。Cx43还可以通过增加星形胶质细胞半通道的开放、减少全通道的活性来增加神经细胞的敏感性，促进细胞死亡的发生[4-5]。缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α）可以促进凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X，BAX）的表达，B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白下调，而HIF-1α敲除后可以明显抑制缺血缺氧性脑损伤[6-7]。也有研究表明，HIF-1α的高表达可以促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达，激活血管内皮细胞生长因子受体2通路，促进脑血管的新生[8]。鉴于Cx43在缺血缺氧性脑病中的重要作用，本研究对糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）条件下，HIF-1α 上调Cx43表达造成星形胶质细胞损伤的作用机制进行了进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 主要材料 人星形胶质细胞HA细胞株（实验室自备）；HEK293T细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：CL0005）；大肠杆菌感受态细胞 DH5α（北京天根生化科技有限公司，批号：CB10101）；慢病毒载体GV218、阴性对照慢病毒（上海吉凯公司，批号：K857435）；RT-qPCR试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：18573364）；质粒抽提试剂盒（美国Promega公司，批号：194754）；DMEM、Opti-MDM 培养基（美国 Invitrogen公司）；Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen公司）；HIF-1α和Cx43的引物（上海生工生物工程公司合成）；HIF-1α 的小干扰 RNA（siRNA）及对照（苏州吉玛公司）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：C0038）；Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号：556547）；TUNEL染色试剂盒（美国Roche公司，批号：11767305001）；谷氨酸水平检测试剂盒（美国 Biovision公司，批号：629100）；TNF-α、IL-6的ELISA检测试剂盒（上海酶联生物有限公司，批号：1077385、1058097）；Bcl-2、B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因相关启动子（Bad）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、细胞色素 C（Cyt-C）、Cx43、HIF-1α 的单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，批号：15071、189208、966208、11940、3512、36169）；蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：1800125）。

1.2 过表达HIF-1α的HA细胞系的构建 将制备的质粒20 μg与Opti-MEM培养基混合，用Lipfeceamine 2000转染至HEK293T细胞（用于质粒的扩增和提取）。培养12 h后，弃去培养基，更换完全培养基继续培养48 h，收集上清液后用0.45 μm的滤膜过滤，离心后得到扩增后的质粒浓缩液。HA细胞生长至对数期，将质粒浓缩液稀释后与HA共培养，进行质粒的转染，24 h后吸去培养基，更换完全培养基继续培养。同时设置阴性对照组。将过表达HIF-1α的HA细胞定为HIF-1αlent组，而阴性组为NC-lent组，未经过处理的HA细胞为Con组。

1.3 siRNA沉默HA细胞中HIF-1α基因的表达 取对数期的细胞进行转染，将细胞接种于6孔板内，待细胞长至80%左右进行转染。设置对照组（Con，未经过处理的HA细胞）、siRNA阴性对照组（siRNA-NC）和siRNA-HIF-1α组。将siRNA-HIF-1α溶解于Opti-MEM培养基中，室温孵育5 min，另外取Lipofectamin 2000溶解于Opti-MEM培养基中，室温孵育5 min，混合2种Opti-MEM液，孵育5 min后加入HA细胞中，室温孵育6 h后更换为正常的完全培养基进行培养。48 h后进行转染效率的检测。

1.4 HIF-1α、Cx43 mRNA表达水平检测 采用RT-qPCR法。将细胞接种至6孔板中，分组后置于OGD条件下（将细胞置于缺氧罐中模拟OGD环境）培养24 h。培养完成后细胞刮刮下细胞并收集。Trizol试剂裂解细胞后提取总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，设置GAPDH为内参，GAPDH上游引物:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；HIF-1α 上游引物 ：5′-CAAAACACACAGCGAAGC-3′，下游引物：5′-TCAACCCAGCATATCCACC-3′；Cx43 上游引物 ：5′-TCACTGGGGTGACTTCACTACTTT-3′，下游引物：5′-AGGCTGACTCAACCGCTGTC-3′。逆转录合成的反应条件为 70 ℃ 5 min，0 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70℃ 10 min，-20℃保存。PCR的反应体系为20 μl，其中 SYBR Premix Ex Taq 10 μl、cDNA 2 μl、上下游引物各 0.4 μl、CEPC 水 7.2 μl。PCR 扩增反应条件为:94 ℃5 min预变性，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30个循环，72 ℃延伸 10 min。采用 2-ΔΔCt相对定量法，以GAPDH为内参，分析mRNA的相对表达水平。

1.5 HIF-1α、Cx43、细胞凋亡相关蛋白 Bad、Caspase-3、Cyt-C、Bcl-2蛋白表达水平检测 采用Western blot法。将细胞接种至6孔板中，分组后置于OGD条件下培养24 h。培养完成后细胞刮刮下细胞并收集。PBS洗2次后，在冰上加入NP-40裂解液100 μl裂解30 min，同时不定时震荡，保证裂解液的充分接触。3 000 r/min离心15 min，收集上清液后BCA试剂盒进行蛋白浓度的定量并调整蛋白浓度，电泳，转膜，PVDF膜使用5%脱脂奶粉封闭2 h，用TBST稀释一抗（单克隆抗体），4℃一抗过夜孵育，次日取出PVDF膜后用TBST洗2次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗在37℃孵育4 h。孵育完成后用化学发光法检测，采用Image Pro-Plus 6.0软件进行灰度值的分析，以GAPDH为内参，结果以目的蛋白光密度值与内参蛋白光密度值之比表示。

1.6 细胞活力检测 采用CCK-8法。OGD条件下培养3、6、9、12、15、18、21、24 h 后，加入 10 μl的 CCK-8 试剂，在常规培养条件下继续孵育4 h，同时设置空白对照。孵育完成后在480 nm处检测吸光度（OD）值。细胞活力=[（OD实验组-OD背景）/（OD对照组-OD背景）]×100%。

1.7 细胞凋亡率检测 将细胞接种到6孔板中，OGD条件下培养24 h，收集细胞后加入Binding Buffer重悬。而后加入Annexin V-FITC液10 μl混匀避光反应10 min，再加入10 μl的PI染色避光反应10 min，PBS洗去多余染色液后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 谷氨酸水平检测 将细胞接种至6孔板中，分组后置于OGD条件下培养24 h。培养完成后细胞刮刮下细胞并收集。按照细胞个数1 000∶2的比例加入试剂（1 000个细胞加入2 μl），破碎细胞后常温下离心，取上清液。采用分光光度法检测570 nm处的OD值，然后根据标准曲线测定谷氨酸水平。谷氨酸水平以mg/L表示。

1.9 培养基中炎症因子NO、TNF-α、IL-6表达水平检测 采用ELISA法。将细胞接种至6孔板中，分组后置于OGD条件下培养24 h。取细胞培养基后离心，得到上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.10 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α对于OGD条件下Cx43表达的影响 慢病毒过表达HIF-1α后，相比Con组和NC-lent组，HIF-1α-lent组HIF-1α及Cx43 mRNA和蛋白表达水平在OGD条件下均上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而siRNA沉默HIF-1α后，相比Con组和siRNA-NC组，siRNA-HIF-1α组 HIF-1α 及 Cx43 mRNA和蛋白表达水平在OGD条件下均下调，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见图 1。

2.2 HIF-1α对于OGD条件下HA细胞活力的影响慢病毒过表达HIF-1α后，不同时间点Con组和NC-lent组细胞活力比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和NC-lent组，HIF-1α-lent组细胞活力下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），siRNA沉默HIF-1α 后，OGD 条件下处理 3、6、9、12、15、18、21、24 h，不同时间点Con组和siRNA-NC组细胞活力比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和siRNA-NC组，siRNA-HIF-1α组细胞活力升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见图 2。

2.3 HIF-1α对于OGD条件下HA细胞凋亡率的影响慢病毒过表达HIF-1α后，Con组、NC-lent组和HIF-1α-lent组细胞凋亡率分别为（32.35±3.15）%、（37.32±4.15）%和（63.54±5.12）%。相比 Con组和 NC-lent组，HIF-1α-lent组细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。siRNA 沉默 HIF-1α后，Con组、siRNANC组和siRNA-HIF-1α组细胞凋亡率分别为（42.35±5.14）%、（40.24±4.12）%和（18.65±2.13）%。相比 Con 组和siRNA-NC组，siRNA-HIF-1α组细胞凋亡率下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图1 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺（OGD）条件下缝隙连接蛋白（Cx43）表达的影响[（a：HIF-1α对于OGD条件下HIF-1α和Cx43蛋白表达水平的电泳图；b：HIF-1α和Cx43 mRNA表达水平结果；c：HIF-1α和Cx43蛋白表达水平结果；d：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43 mRNA表达水平结果；e：沉默HIF-1α后，HIF-1α和Cx43蛋白表达水平结果；与Con组比较，*P＜0.05；与 NC-lent组和小干扰 RNA（siRNA）-NC 组比较，△P＜0.05]

图2 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺条件（OGD）条件下HA细胞活力的影响[a：HIF-1α过表达后，细胞活力改变的结果；b：沉默HIF-1α后，细胞活力改变的结果；与Con组比较，*P＜0.05；与小干扰RNA（siRNA）-NC组和NC-lent组比较，△P＜0.05]

图3 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺（OGD）条件下HA细胞凋亡率的影响（siRNA为小干扰RNA）

2.4 HIF-1α对于OGD条件下HA细胞谷氨酸水平的影响 慢病毒过表达HIF-1α后，Con组和NC-lent组细胞中谷氨酸水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而相比Con组和NC-lent组，HIF-1α-lent组细胞中谷氨酸水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con组和siRNA-NC组细胞中谷氨酸水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；而相比Con组和siRNA-NC组，siRNA-HIF-1α组细胞中谷氨酸水平下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺（OGD）条件下HA细胞谷氨酸水平的影响[与Con组比较，*P＜0.05；与NC-lent组和小干扰 RNA（siRNA）-NC 组比较，△P＜0.05]

2.5 HIF-1α对于OGD条件下HA细胞培养基中NO、TNF-α、IL-6表达的影响 慢病毒过表达HIF-1α后，Con组和 NC-lent组细胞中NO、TNF-α、IL-6表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和NC-lent组，HIF-1α-lent组细胞培养基中NO、TNF-α、IL-6表达水平均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con组和siRNA-NC组细胞培养基中NO、TNF-α、IL-6表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和siRNANC 组，siRNA-HIF-1α 组细胞培养基中 NO、TNF-α、IL-6表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

2.6 HIF-1α对于OGD条件下HA细胞凋亡相关蛋白表达的影响 慢病毒过表达HIF-1α后，Con组和NC-lent组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和NC-lent组，HIF-1αlent组中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表达水平均上调，而Bcl-2蛋白表达水平下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。siRNA沉默HIF-1α后，Con组和siRNA-NC组细胞凋亡相关蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而相比Con组和siRNA-NC组，siRNA-HIF-1α组中Bad、Caspase-3、Cyt-C蛋白表达水平均下调，而Bcl-2蛋白表达水平上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 6。

3 讨论

图5 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺（OGD）条件下培养基中炎症因子NO、TNF-α、IL-6表达的影响[a：HIF-1α过表达后，NO、TNF-α、IL-6 的表达水平；b：沉默 HIF-1α 后，NO、TNF-α、IL-6 的表达水平；与 Con 组比较，*P＜0.05；与 NC-lent组和小干扰RNA（siRNA）-NC 组比较，△P＜0.05]

图6 缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对于糖氧剥夺（OGD）条件下HA细胞凋亡相关蛋白表达的影响 [a：HIF-1α对于OGD条件下HA细胞凋亡相关蛋白表达的电泳图；b：HIF-1α过表达后，蛋白的相对表达水平；c：HIF-1α沉默后，蛋白的相对表达水平；Bad为B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关启动子；Caspase-3为半脱氨酸蛋白酶-3；Cyt-C为细胞色素C；Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关X蛋白；与Con组比较，*P＜0.05；与NC-lent组和小干扰RNA（siRNA）-NC 组比较，△P＜0.05]

HIF-1是一个在缺血缺氧状态下调节氧稳态的转录因子，有异源二聚体α和β亚基组成，和促红细胞生成素基因上的低氧反应原件结合[9]。其中HIF-1α是较为重要的转录因子，在缺氧条件下，细胞内的HIF-1α表达水平增高，转移至细胞核内并且持续高表达，同时不受到氧浓度的影响[10]。在缺氧性脑病的研究中发现，脑损伤的发生和HIF-1α具有密切的关系，一方面，HIF-1α可以促进促红细胞生成素及受体的表达，诱导脑红蛋白和血管生长因子的表达，启动应激反应[11]；另一方面可以调控细胞定向迁移、促进集体修复。可以说HIF-1α具有双刃剑的作用，且与多种基因和信号的改变有关。凋亡是脑缺血缺氧后细胞死亡的一种方式。有研究表明HIF-1α可以调控细胞的凋亡[12-13]。在血管内皮细胞的研究中已经发现，RNA干扰HIF-1α的表达后，在OGD条件下，细胞凋亡受到抑制[14]。而Williams等[15]研究发现HIF-1α调控凋亡的作用和凋亡基因Bad、Bax依赖性有关。HIF-1α还可以通过负反馈调节细胞的凋亡，凋亡抑制基因Survivin是凋亡蛋白抑制基因家族成员，当HIF-1α沉默后，缺氧条件下Survivin基因的表达受到HIF-1α的调控，且表达上调，同时抑制了缺血缺氧条件下神经细胞的凋亡[16]。

Cx43是缝隙连接蛋白的一种，是细胞通讯的主要方式之一。缺血性损伤后，半通道由关闭转向开放状态，介导物质的转运[17]。研究发现，缺血缺氧后，Cx43的表达显著增高，尤其是磷酸化水平增高，且脑损伤的程度和Cx43的细胞内转位和表达水平增高呈正比[18]。Retamal等[19]研究发现，抗霉素A处理抑制Ast后，Cx43通道开放，同时细胞内染料的摄取量增高。Kalvelyte等[20]研究发现，Cx43过表达后，可以加速Hela细胞的凋亡程度。Cx43在星形胶质细胞中的表达水平最高，分布也最为广泛。星形胶质细胞作为神经细胞的辅助性细胞，在缺血缺氧性脑损伤中具有广泛的作用。当Cx43表达增高后，可以介导星形胶质细胞的损伤，同时释放炎症因子，扩大损伤。但是目前Cx43的表达调控机制尚不清楚。

鉴于HIF-1α作为转录因子的重要作用，本实验采用了过表达和siRNA沉默方法研究HIF-1α对于Cx43的调控作用。结果显示，在HIF-1α过表达后，OGD条件下，Cx43的表达也增高，两者呈正相关。同时星形胶质细胞中炎症因子的表达增高，细胞凋亡率增高。这提示，HIF-1α可以调控Cx43的表达，同时Cx43高表达后进一步促进了星形胶质细胞的损伤。而siRNA沉默HIF-1α后，Cx43的水平也下调，抑制了星形胶质细胞的损伤。因此，从过表达和基因沉默实验结果来看，HIF-1α可以调控Cx43的表达，以此影响星形胶质细胞的状态。

综上所述，本实验发现HIF-1α可以通过调控Cx43的表达来影响缺血缺氧下星形胶质细胞的损伤，这是HIF-1α在缺血缺氧性脑病损伤中的作用机制之一。