槲皮素对17α-乙炔雌二醇诱导胆汁淤积的肝保护作用研究

涂君雪 黄婉然 何储君 郑毅

胆汁淤积是由各种内外原因引起的胆汁排泄障碍，胆汁酸累积于肝脏，导致肝损伤，进一步可发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌，甚至肝功能衰竭[1]。雌激素及其类似物体内水平过高易引起妊娠期妇女，口服避孕药和接受雌激素替代疗法妇女的肝内胆汁淤积[2]。目前胆汁淤积治疗药物缺乏，熊去氧胆酸是FDA批准的唯一用于胆汁淤积治疗的一线药物，但约40%的患者对其应答不佳，晚期胆汁淤积患者只能通过肝移植延续生命，因而迫切需要寻求新的有效治疗药物[3]。槲皮素（quercetin，Que）为五羟基黄酮类化合物，不溶于冷水，难溶于热水，可溶于碱性溶液[4]，广泛分布于茶叶、苹果、洋葱等植物性食物中[5]。既往研究已证实Que具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗血小板聚集、肝细胞保护等多种药理作用[6]。且有研究表明Que可通过抑制肝星状细胞活化来预防肝纤维化，对胆管结扎和四氯化碳诱导的大鼠肝损伤和纤维化具有良好的保护作用[7]，然而Que对雌激素诱导胆汁淤积的作用尚不清楚。本实验采用17α-乙炔雌二醇（17α-ethynylestradiol，EE）诱导建立胆汁淤积模型，探讨Que对EE诱导胆汁淤积的肝保护作用及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级8周雄性SD大鼠32只，重量（240±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0011。所有动物饲养于标准实验条件，温度控制在25℃，昼夜交替，适应性喂养1周。

1.2 试剂与仪器 Que（≥95%，美国sigma公司，Q4951）；EE（美国Sigma公司，E4876）；羧甲基纤维素钠（安徽山河药用辅料股份有限公司）；Trizol试剂（美国Thermo Fisher公司，180608）；ALT测试盒（20180701），AST测试盒（20180611），ALP测试盒（20180415），胆汁酸测试盒（20180709）均购自南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒与荧光定量试剂盒（日本Takara公司，R037A）；荧光定量PCR仪（7500 Applied Biosystems，美国Thermo Fisher公司）；倒置显微镜（IX71，日本 Olympus公司）；低温高速离心机（Sorvall ST8R，美国Thermo Fisher公司）；多功能酶标仪（ELX800，美国 BioTek公司）；核酸测定仪（Nanodrop 2000c，美国Thermo Fisher公司）。

1.3 实验分组 按照随机数字表法将大鼠分为对照组、模型组、给药组（Que 50 mg/kg组和Que 100 mg/kg组），每组8只。模型组及给药组连续5 d皮下注射5 mg/kg EE溶液（溶于丙二醇，注射体积为0.1 ml/100 g）造模，造模成功20只，其中模型组6只，Que 50 mg/kg组和Que 100 mg/kg组各7只；对照组皮下注射EE溶剂丙二醇（注射体积为0.1 ml/100g）。对照组及模型组予Que溶剂0.5%羧甲基纤维素钠溶液（灌胃体积为1 ml/0.1 kg）灌胃，Que 50 mg/kg组和Que 100 mg/kg组分别予50和100 mg/kg Que（溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液，灌胃体积为1 ml/0.1 kg）灌胃。1次/d，连续4周，最后一次给药后禁食过夜。

1.4 大鼠胆汁流量测定 大鼠胆管插管收集胆汁。采用2%戊巴比妥（0.15 ml/100 g）麻醉大鼠，将大鼠以仰卧位固定在大鼠板上；剔除毛发，乙醇消毒，从剑突下1 cm处用手术剪剪开小口，确认十二指肠位置，翻转十二指肠找到淡黄色的胆管，轻轻分离周围的肠系膜；胆管下方穿一根手术线，用眼科剪顺着胆管方向剪一个小口，插入PE导管，用手术线结扎固定，收集1 h内的胆汁酸，将胆汁的密度按1 g/ml计算，按照[（样品管重量-空管重量）×1 g/ml]/（时间×体重）计算胆汁流量。

1.5 血清生化指标测定 眼眶取血收集血清，严格按照生化试剂盒说明书的操作流程测定大鼠血清中ALP、AST、ALT水平，评价肝脏的损伤程度及Que的药理作用。

1.6 HE染色 将大鼠处死并液氮速冻收集肝脏组织，保存于-80℃备用。组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片，二甲苯脱钠，HE染色，常规脱水，封片，在光学显微镜下观察染色情况。

1.7 胆汁酸测定 取100 mg左右的肝脏组织置于玻璃匀浆器中，加入9倍体积的冰PBS溶液，充分匀浆，随后以3 000 g 4℃离心10 min，取上清液即为制备的肝组织匀浆液。取血清或肝组织匀浆液，按照胆汁酸测定试剂盒说明检测血清与肝脏中胆汁酸水平。

1.8 肝组织胆汁酸摄取转运体、外排转运体、胆汁酸合成酶及代谢酶mRNA表达测定 采用RT-qPCR法测定胆汁酸摄取转运体[钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）和有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide,OATP）1A2 和 OATP1B1]、外排转运体[胆汁酸盐输出泵（bile salt export pump，BSEP）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP）2、MRP3和 MRP4]、胆汁酸合成酶[细胞色素 P450酶（cytochrome P450，CYP）7A1、CYP8B1 和 CYP27A1]及代谢酶[CYP3A2、CYP2B10、硫酸基转移酶（sulfotransferase，SULT）2A1和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyl transferases,UGT）1A1]的mRNA表达情况。将40 mg左右的肝脏组织置于玻璃匀浆器中，加入500 μl Trizol试剂，冰上研磨，移取液体至EP管中，加入200 μl氯仿，用手上下剧烈震荡15 s，放置15 min。随后在冷冻离心机中12 000 g 4℃离心15 min。取上清液，加入等量的异丙醇，震摇混匀后，静置10 min，12 000 g 4℃离心10 min，倒去液体，加入75%乙醇溶液，涡旋洗涤沉淀，8 000 g 4℃离心5 min，尽量吸干乙醇溶液，晾干，沉淀未完全干燥时加入60 μl PCR水。使用核酸测定仪测定RNA纯度及浓度，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。使用荧光定量试剂盒，采用两步法PCR程序扩增，记录数据，以β-actin为内参计算相对表达。引物序列见表1。

1.9 统计学处理 采用Graphpad 5.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏组织学损伤比较 肝脏组织学检查表明，对照组大鼠肝脏结构正常，而EE诱导了肝毒性。给予大鼠EE后可见肝脏大量炎性细胞浸润，肝细胞水肿，肝组织大面积坏死。给予50 mg/kg Que可见明显减少的炎症浸润，坏死面积减小，水肿缓解。而给予100 mg/kg Que的大鼠炎性细胞浸润、水肿和坏死显著改善，已接近对照组大鼠水平，见图1。

2.2 各组大鼠血清生化指标比较 模型组大鼠血清AST、ALT和ALP水平均明显高于对照组（均P＜0.01）；AST仅在给予100 mg/kg Que后较模型组降低（P＜0.01），而给予50和100 mg/kg Que后可呈剂量依赖性降低ALT、ALP 水平（均 P＜0.05），且 Que 100 mg/kg组已恢复至对照组大鼠水平，见图2。

2.3 各组大鼠胆汁流量和胆汁酸水平比较 EE诱导的胆汁淤积可明显减少大鼠的胆汁流量（P＜0.01），给予50和100 mg/kg Que可呈剂量依赖性增加大鼠胆汁流量（均P＜0.01）。EE处理大鼠血清及肝脏的胆汁酸水平均升高（均P＜0.01），而给予100 mg/kg Que后，可明显降低血清及肝脏的胆汁酸水平（均P＜0.05），见图3。

表1 RT-qPCR引物序列

图 1 肝脏组织学检查所见（a：对照组；b：模型组；c：Que 50 mg/kg组；d：Que 100 mg/kg组；Que为槲皮素；HE 染色，×200）

2.4 各组大鼠肝脏胆汁酸摄取转运体的表达比较 EE诱导胆汁淤积大鼠NTCP、OATP1A2、OATP1B1表达水平降低（P＜0.05），给予100 mg/kg Que后可见NTCP表达相比于模型组显著降低（P＜0.05），而Que对OATP1A2、OATP1B1的表达无明显影响，见图4。

2.5 各组大鼠肝脏胆汁酸外排转运体的表达比较 EE诱导的胆汁淤积可显著降低肝脏BSEP及MRP2的表达（均P＜0.05），而给予100 mg/kg Que后可增高MRP2表达（P＜0.05），而给予Que后可呈剂量依赖性增高BSEP表达（均P＜0.05）。EE诱导的胆汁淤积可适应性上调MRP3、MRP4表达，100 mg/kg Que可增高 MRP3的表达（均P＜0.05），而50和 100 mg/kg Que均可增高MRP4的表达（均P＜0.05），见图5。

2.6 各组大鼠肝脏胆汁酸合成酶的表达比较 EE可明显降低 CYP7A1、CYP8B1和 CYP27A1的表达（均P＜0.05），给予50和100 mg/kg的Que后可进一步降低CYP7A1的表达（均P＜0.05），给予100 mg/kg的Que后可降低CYP8BI的表达（P＜0.05），而 Que对 CYP27A1的表达无明显影响，见图6。

图2 各组大鼠血清生化指标比较（a：各组大鼠血清AST水平比较；b：各组大鼠血清ALT水平比较；c：各组大鼠血清ALP水平比较；Que为槲皮素；与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

图3 各组大鼠胆汁流量、血清和肝脏胆汁酸水平比较（a：各组大鼠胆汁流量比较；b：各组大鼠血清胆汁酸水平比较；c：各组大鼠肝脏胆汁酸水平比较；Que为槲皮素；与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01）

图4 各组大鼠肝脏胆汁酸摄取转运体的表达比较[a：各组大鼠钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）表达比较；b：各组大鼠有机阴离子转运多肽（OATP）1A2表达比较；c：各组大鼠OATP1B1表达比较；Que为槲皮素；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05]

图5 各组大鼠肝脏胆汁酸外排转运体的表达比较[a：各组大鼠胆汁酸盐输出泵（BSEP）表达比较；b：各组大鼠多药耐药相关蛋白（MRP）2表达比较；c：各组大鼠MRP3表达比较；d：各组大鼠MRP3表达比较；Que为槲皮素；与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01]

图6 各组大鼠肝脏胆汁酸合成酶的表达比较[a：各组大鼠细胞色素P450酶（CYP）7A1表达比较；b：各组大鼠CYP8B1表达比较；c：各组大鼠 CYP27A1 表达比较；Que 为槲皮素；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01]

2.7 各组大鼠肝脏胆汁酸代谢酶的表达比较 EE可明显降低CYP3A2和CYP2B10的表达（均P＜0.01），而给予100 mg/kg Que后CYP3A2的表达增加（P＜0.01），Que可剂量依赖性增加CYP2B10的表达（均P＜0.05）。同样EE可明显降低SULT2A1和UGT1A1的表达（均P＜0.05），给予Que可显著增加SULT2A1的表达（均P＜0.05），而Que对UGT1A1的表达无明显影响，见图7。

3 讨论

Que是一种天然黄酮类化合物，已被证实具有多重生物活性和保肝作用[6]，而是否对雌激素诱导的胆汁淤积发挥作用尚不清楚。本实验结果表明Que对雌激素诱导的胆汁淤积具有较好的肝保护作用，可明显缓解肝脏组织学变化，降低血清AST、ALT、ALP水平，增加胆汁流量，显著降低肝脏和血清胆汁酸水平，缓解毒性胆汁酸累积。

胆汁酸转运体在维持胆汁酸平衡中发挥着至关重要的作用[8]。肝脏胆汁酸转运体主要分为摄取转运体与外排转运体，摄取转运体主要位于肝细胞血窦侧，而外排转运体在血窦侧与胆管侧均有分布[9]。NTCP和OATP家族是位于肝细胞血窦侧的主要摄取转运体，负责从血液循环中摄取胆汁酸进入肝细胞[10]。NTCP主要负责摄取大部分的结合型胆汁酸，而OATP家族主要担任非结合型胆汁酸的摄取[11]。本实验结果表明，EE可明显抑制NTCP、OATP1A2、OATP1B1的表达，从而适应性降低胆汁酸的摄取，胆汁淤积大鼠给予Que后可进一步降低NTCP的表达，从而抑制胆汁酸的重吸收，而对OATP1A2、OATP1B1的表达无明显影响。

图7 各组大鼠肝脏胆汁酸代谢酶的表达比较[a：各组大鼠细胞色素P450酶（CYP）3A2表达比较；b：各组大鼠CYP2B10表达比较；c：各组大鼠硫酸基转移酶（SULT）2A1表达比较；d：各组大鼠尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）1A1表达比较；Que为槲皮素；与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01]

BSEP和MRP2是位于肝细胞胆管侧的主要外排转运体，负责将肝脏中胆汁酸外排到胆汁中[8]。BSEP底物较广，包括非结合型胆汁酸及牛磺酸、甘氨酸和硫酸结合型胆汁酸，对牛磺结合型胆汁酸具有较高的亲和力[11]。MRP2可转运二价胆汁酸如硫酸化牛磺胆酸和甘氨胆酸，但不能转运一价胆汁酸。BSEP和MRP2的功能正常是维持胆汁酸肠肝循环的重要环节[12]。EE可明显降低BSEP与MRP2的表达，而给予Que后显著增加两者的表达。MRP3和MRP4是位于肝细胞血窦侧的外排转运体，在正常生理情况下表达较低，而在胆汁淤积患者中的表达水平增加，主要参与结合型胆汁酸外排至血液循环。本实验结果表明EE诱导的胆汁淤积大鼠肝脏MRP3和MRP4的表达略有增加，而给予Que后，可明显增高MRP3和MRP4的表达水平，因而Que通过促进胆管侧与血窦侧胆汁酸外排转运体的表达从而促进肝内胆汁酸的外排。

胆汁酸在肝脏由胆固醇经CYP7A1和CYP8B1介导的经典途径及CYP27A1介导的替代途径合成[13]。经典途径合成人体约90%的胆汁酸，主要合成初级的胆酸及鹅去氧胆酸[14]。CYP7A1是细胞色素P450家族的一员，为胆汁酸合成的关键限速酶，而CYP8B1则是合成胆酸过程所必须的酶[15]。CYP27A1介导的替代途径主要合成鹅去氧胆酸[16]。本实验中，EE可明显降低CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1的表达，可能为机体适应性调节而降低胆汁酸的合成，而给予Que后可一步抑制经典途径CYP7A1和CYP8B1的表达，而对替代途径的CYP27A1无明显影响，从而进一步抑制胆汁酸的合成。

胆汁酸代谢由Ⅰ相代谢与Ⅱ相代谢组成[14]。CYP3A2和CYP2B10是介导胆汁酸Ⅰ相代谢的关键酶，负责将胆汁酸生物转化成高亲水性和非毒性胆汁酸（如鼠胆酸）[17]。Ⅱ相代谢为胆汁酸结合反应，在胆汁酸合成之后，大部分胆汁酸可快速与氨基酸（甘氨酸和牛磺酸）结合，也可经硫酸化转移酶SULT2A1催化与硫酸基结合，或经UGT1A1作用进行葡萄糖醛酸化[18]。EE可明显降低 CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1 和 UGT1A1的表达，而给予Que后，可明显降低CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1，而对UGT1A1的表达无明显影响。由此可知，Que可通过抑制胆汁酸的合成，促进胆汁酸的代谢而减轻肝脏胆汁淤积。

综上所述，Que对EE诱导的胆汁淤积肝损伤具有明显的保护作用，机制与其抑制摄取转运体NTCP和合成酶CYP7A1与CYP8B1的表达而降低肝脏胆汁酸重吸收和合成，促进外排转运体BSEP、MRP2、MRP3、MRP4与代谢酶 CYP3A2、CYP2B10、SULT2A1的表达从而促进胆汁酸的外排和代谢密切相关。Que具有被开发成为新型治疗胆汁淤积药物的前景。