母猪卵泡发育同步化调控技术研究及应用

秦玉圣，白佳桦，田见晖，冯 涛，宋玉清，肖霖力，黄 正，翁士乔，刘 彦*

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.北京菲繁生物技术有限公司，北京 100142；4.宁波三生生物科技有限公司，浙江 宁波，315105）

生猪产业是我国畜牧业的重要支柱，我国不仅是世界上最大的猪肉生产国，同时也是最大的猪肉消费国。自2018年8月国内首次出现非洲猪瘟疫情后，其大面积迅速暴发，导致我国能繁母猪存栏急剧下降，对生猪产业经济造成巨大损失。但通过此次疫情，国内的生猪生产理念正在得到根本转变，生物安全防控意识得到空前提高，基于母猪定时输精技术的批次化全进全出生产管理模式得到行业人员的更多关注。母猪定时输精技术的实现前提是猪群发情周期同步化、卵泡发育同步化、排卵同步化和配种同步化，也就是既要发情周期的同步又要卵泡发育及排卵的同步。文章就母猪卵泡发育的同步化技术及其在定时输精中的应用进行简要介绍。

1 发情周期同步化

欲母猪卵泡发育同步化，首先需要确保其发情周期同步。经产母猪哺乳期间，由于仔猪吮吸乳头刺激促乳素的分泌，负反馈抑制促性腺激素释放激素（GnRH）的释放，使母猪卵泡静止不发育，统一断奶后，由于同时解除了对GnRH的抑制，经产母猪发情周期也达到同步化。同样，通过激素制剂调控也可实现母猪发情周期的同步化，例如对处在不同发情周期的后备母猪，通过连续14～18 d饲喂15～20 mg/d烯丙孕素的措施，能有效阻止卵泡发育，当停喂烯丙孕素后，后备母猪群可实现发情周期的同步化。

2 卵泡发育同步化

经上述发情周期同步处理，依然存在母猪发情的个体差异较大，以及静立发情、排卵较分散的问题，无法实现定时输精，原因在于母猪卵泡发育尚未达到同步。

2.1 母猪卵泡发育尚未达到同步的原因

1）母猪断奶后卵泡会呈现多种发育状态。由于母猪个体差异比较明显，卵泡发育速度千差万别（图1）。有的母猪断奶时卵泡直径较大，但在随后的发育过程中生长速率却相对较慢，从而在正常时间区间内发情。另有部分母猪断奶时的卵泡直径较大，但正在发生闭锁，断奶发情需要启动新的卵泡波，因此，断奶发情间隔变长，其发情时间晚于断奶时卵泡较小的母猪。此外，还有一些母猪断奶时直径为5～6 mm的卵泡受到促黄体素（LH）的刺激，从卵泡闭锁波中逃脱，这部分母猪断奶发情间隔仅为3～4 d，并且快速进入排卵前阶段[1]。由此可见，即使发情周期实现同步化，但卵泡发育仍然不同步。

2）母猪卵泡发育是受生殖激素的调控。母猪断奶后往往受多种因素影响，会干扰LH等激素的分泌进而影响到卵泡的发育进程。研究发现，经产母猪断奶前后释放LH的模式不同，断奶前表现为低频高振幅，断奶后则以高频低振幅为特点（图2）。

图1 母猪断奶-排卵期间卵泡直径的变化（取自3～5个最大卵泡的平均直径）；（A）初产母猪断奶-排卵间隔（◇：小于 6 d；■：6-7 d；△：8-9 d；※：大于 10 d）；（B）经产母猪断奶-排卵间隔（▲：4 d；■：5 d；◆：6 d）

图2 母猪断奶前LH分泌模式（A）和断奶后分泌模式（B）

图3 B超实时超声断奶母猪巢卵泡生长图像 A：母猪断奶时卵泡直径约3 mm； B：母猪断奶后86～96 h卵泡直径约6～8 mm（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

哺乳期间母猪能量负平衡会干扰LH的释放模式，而卵泡发育、成熟与LH脉冲密切相关。尤其是初产母猪，断奶时卵泡发育受LH影响较大，其断奶时卵泡直径平均约为2.5 mm，排卵时直径达到7.0 mm。经产母猪断奶时卵泡发育受LH脉冲影响相对较小，断奶、排卵时卵泡平均直径分别为3.3 mm 和 8.0 mm[2]（图 3）。

2.2 促卵泡发育的激素制剂研发应用

卵泡发育是复杂的生物学事件，定时输精需使卵泡发育同步化，但是不同生殖激素发挥着不同的作用。研究表明用纯化后的促卵泡素（FSH）、LH每8 h处理一次母猪，连续处理64 h后发现，经FSH处理的母猪卵巢上3～6 mm的窦状卵泡数量很多，但直径均没有突破6 mm。经LH处理的母猪卵巢卵泡数量虽然少，但已达到排卵卵泡直径标准7～9 mm，这说明FSH可以增加中等卵泡的数量（卵泡募集），但卵泡进一步生长、发育则需要LH的刺激（卵泡优势化）。

为使母猪卵泡发育达到同步此，可采用外源性促性腺激素对卵泡发育进行调控。目前，刺激卵泡发育的常见激素有孕马血清（PMSG/eCG）、PG600、以及GnRH的激动剂等。

PMSG属于糖蛋白，其兼有FSH和LH的活性，但以FSH活性为主，在刺激卵泡同步发育方面具有很好的效果。研究表明经产母猪断奶后24 h注射500～750 IU的PMSG能促使母猪卵泡同步发育，后备母猪和初产母猪由于内源性LH浓度较低，在应用PMSG促进母猪卵泡发育时剂量需增加到900～1 000 IU，停喂烯丙孕素后40 h肌肉注射1 000 IU的PMSG可促进卵泡同步发育。虽然PMSG促进卵泡发育取得较好的效果，但国内外研究认为PMSG产品批次之间生物活性差异很大，导致应用效果不稳定，因此，除了在生产提取工艺上对PMSG进行纯化外，PMSG与人绒毛膜促性腺激素（hCG）等激素组合也被用于研究母猪卵泡同步发育。

PG600是由400 IU的PMSG和200 IU的hCG组成，研究显示PG600处理母猪不仅可缩短断奶发情间隔，卵泡发育速度也更快、断奶后同一时间点卵泡直径更大。PG600处理泌乳母猪时，虽然能刺激卵泡发育至排卵前阶段，但断奶发情间隔显著延长。并且，可能是由于hCG具有LH效应，两者组合使用引起一定比例的卵泡囊肿或黄体化。研究表明，当PMSG、hCG剂量分别从400 IU增加到700 IU、200 IU增加到350 IU时，母猪卵巢囊肿病变率由36%升至88%，同时妊娠率显著下降。德国经过大量试验表明，经纯化冻干后的PMSG粉剂用于刺激卵泡发育时，母猪受胎效果要显著优于PMSG和hCG的联合制剂。

GnRH的激动剂如Maprelin也可以用于刺激卵泡同步发育，并被认为是PMSG的替代品。Maprelin注射阉猪时表现出FSH活性，研究表明其用于刺激初产、经产母猪时卵泡发育、配种受胎率等指标与PMSG相当。hCG也能够促进卵泡的发育，但配种后母猪受胎率受到一定的影响。目前，诱导母猪卵泡同步发育研究及应用方面，依然以PMSG为主。

3 卵泡排卵同步化

自然条件下，母猪排卵持续时间长达6 h，这使部分卵子在与精子相遇前，已经失去受精能力或死亡，输精时间不当将直接影响配种受胎率，所以，排卵同步化对于定时输精的成败至关重要。PMSG等促性腺激素虽然可实现母猪卵泡发育同步化，但母猪个体之间受品种、胎次、管理等因素影响，发情差异较大、排卵前LH峰出现时间不一致、排卵时间分散。为使母猪排卵时间更集中，通常需要在注射PMSG基础上再注射促排卵激素进行处理，最终实现卵泡发育及排卵的同步化，为精准定时输精建立基础（图4）。

在排卵的启动中，GnRH起到了关键的调控作用。生理条件下，卵泡分泌的雌激素正反馈作用于下丘脑释放GnRH刺激垂体，促进LH的分泌并达到排卵前LH峰值，引发卵泡破裂排卵。GnRH是由10个氨基酸组成的十肽，第1-4位氨基酸和第9-10位氨基酸高度保守，但第6和第7位、第9和第10位氨基酸之间的肽键极易被裂解酶分解断裂，因此，GnRH在体内极易失活。为提高GnRH的稳定性，人工合成了一系列GnRH类似物，如曲普瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林等等（如图5）。

目前某些GnRH类似物已在国外进行试验研究[3]，并且部分结果表明，GnRH或其类似物可诱导内源性排卵前LH峰的出现，降低发情排卵间隔变异，用于母猪排卵同步化处理（图6）。

3.1 曲普瑞林诱导母猪同步排卵

2000年，kraeling研究发现曲普瑞林能够诱导雌激素处理的后备母猪出现LH峰，随后Baer进一步确认曲普瑞林能够诱导母猪排卵。目前，针对曲普瑞林研究较多的是将其制成凝胶状，并通过特殊注射器定量将药物置于母猪阴道，经黏膜吸收刺激母猪排卵（如图7）。

图4 性周期同步化母猪在PMSG、GnRH处理后达到排卵同步化

图5 GnRH类似物及其分子结构模式图

Knox将曲普瑞林凝胶注入母猪阴道筛选给药时间和剂量[4]。发现200 μg曲普瑞林处理后48 h可使81%的母猪排卵。进一步研究发现，在断奶后72 h、84 h、96 h的不同时间点给予200 μg曲普瑞林阴道凝胶，结果显示处理后40 h，3组母猪排卵比例分别达到56.5%、62.2%和13%；处理后48 h，3组母猪排卵比例均达到64%，同时，自然发情对照组仅有34%母猪出现排卵，此试验说明母猪断奶后96 h给予200 μg曲普瑞林凝胶能使母猪排卵更集中。进一步分析发现，断奶96 h阴道凝胶处理组母猪断奶排卵间隔显著缩短，妊娠率、分娩率达到自然状态下母猪发情鉴定、适时输精生产的水平。试验中，虽然72 h、84 h处理后母猪排卵提前至少10 h，但采用人工输精后，两组配种妊娠率显著降低20%～50%，分娩率降低30%～50%，其可能原因是激素处理时间较早，此时卵子尚未彻底成熟，曲普瑞林诱发LH峰后卵泡提前排卵，导致输精后精子未能与卵子在合适的时间完成受精，也可能是未成熟的卵子受精后胚胎质量较低，在早期发育阶段死亡。

后备母猪经烯丙孕素处理达到发情周期同步化[5]，间隔120 h，分别用 100 μg、200 μg、400 μg 曲普瑞林凝胶诱导其排卵，发现在处理后48 h母猪集中排卵，其中以200 μg剂量组诱导排卵集中度最高（图8）。进一步研究发现，停喂烯丙孕素后96 h、120 h、144 h给予200 μg曲普瑞林处理，结果发现120 h处理组母猪24～48 h内排卵比例达到80%，有效促进后备母猪的同步排卵。

3.2 布舍瑞林诱导母猪同步排卵

布舍瑞林作为GnRH的类似物，在诱导母猪同步排卵方面也获得较多的关注。研究表明，母猪断奶时肌肉注射600 IU的PMSG，间隔90 h后注射布舍瑞林，并在30 h后进行第一次配种，结果发现能够显著缩短母猪断奶到排卵的间隔，并且在布舍瑞林处理后32 h，排卵母猪比例达到95%以上。当仅用布舍瑞林处理断奶母猪时，断奶排卵间隔虽然也能显著缩短，但效果不如与PMSG联合使用。在另一项研究中发现，大白母猪断奶后94 h、104 h肌肉注射布舍瑞林，结果显示，断奶94 h布舍瑞林处理后32～56 h内排卵母猪比例达到100%，而104 h、以及自然发情组排卵母猪比例分别仅有66.7%、68.7%，说明布舍瑞林注射时间点的选择对母猪排卵同步化至关重要。目前，国内兽药企业正在积极开发布舍瑞林相关药物，但其应用于定时输精程序仍需要结合大量生产数据进行分析优化研究。

图6 GnRH类似物单独或与PMSG连用对母猪排卵前LH峰的影响（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

图7 曲普瑞林凝胶阴道给药模式图

图8 后备母猪曲普瑞林凝胶阴道给药剂量筛选

3.3 其他促性腺激素诱导母猪同步排卵

hCG作为LH的类似物，可直接作用于卵巢。20世纪70年代初，东欧部分国家已经在用PMSG预处理母猪后，注射hCG诱导排卵，并且85%～90%的母猪在处理后42 h发生排卵。pLH是猪促黄体生成素，与hCG作用原理一致，研究表明母猪断奶时注射600 IU PMSG，间隔80 h后注射5 mg pLH，通过B超监测排卵时间结果发现母猪在34.25～42.5 h后发生排卵，平均排卵时间为38.2 h。但由于这些激素存在一定的副作用，或提取困难、成本高等缺点，逐渐被市场上其他促排药物代替。

就目前各种促排激素制剂而言，与其他蛋白类诱导排卵激素制剂如hCG、LH相比，GnRH及其类似物能够刺激内源性LH的分泌，并且具有低毒、代谢快、价格低等优点，同时GnRH属于小分子，重复使用不会引起机体产生抗体，安全性高，因此，获得越来越多的关注。

4 卵泡发育同步化在定时输精中的应用

事实上，母猪发情周期、卵泡发育及排卵同步化调控效果与猪场管理、母猪品种、激素制剂效价及稳定性等密切相关。近几年，猪场批次化生产在国内引起了高度关注，不少猪场开始建立三周批次、四周批次等批次化模式生产，先期尝试引入国外的简式或精准定时输精程序，但是出现了诸多效果不一的问题，有人甚至对定时输精技术产生了疑问。为此，国内一些高校、科研单位、动物制药企业与养猪企业相继开展了定时输精技术的研发与生产试验。其中，全国猪定时输精协作组在国家重点研发计划等项目支持下，结合我国实际生产及猪场管理情况，开展了较为系统的定时输精程序的优化研究。通过许多次探索研究，项目组成功将B超技术应用于母猪卵泡的动态检查，以直观呈现卵巢对激素制剂处理的应答效应，直接应用生产中开展定时输精程序优化的研究。借助B超技术对定时输精的激素制剂处理后的卵泡发育实时检查分析[6]，不断进行激素制剂使用与输精时机的调整，通过生产试验建立了母猪发情促排模式的定时输精程序（图9上）；另外，在前期精准式程序基础上优化出了两点式查情定时输精程序（图9下）。

图9 发情促排定时输精程序（上）、两点式查情定时输精（下）

经过多个规模化猪场连续多批次的生产应用，优化的定时输精程序在生产中取得了较稳定的生产效果，显著提高了批次母猪的受胎率、分娩率与利用率，母猪利用率的提高也为批次化生产中母猪群周转安排提供了方便，促进了猪场批次化生产的整体效率提高，有效推动我国规模化猪场连续式生产向批次化生产的转变。