不同消毒剂对冠状病毒消毒效果比较研究

（天津渤海农牧产业联合研究院有限公司,天津 300308）

2019年12月中旬，中国武汉发生“不明原因肺炎”，后经研究人员分离鉴定后认定是由一种新型的冠状病毒引起的严重呼吸系统疾病[1]。2020年2月11日世界卫生组织将新型冠状病毒命名为 COVID-19[2]。21世纪以来除COVID-19外，还出现2种致病性较高的新型人冠状病毒，2003年的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS）、2012年的中东呼吸系统综合征冠状病毒（MERS）。冠状病毒[3]是一类有包膜，包膜上有棘突的单股正链RNA病毒，整个病毒像王冠或日冕而得名，这类病毒广泛存在于自然界中，属于人畜共患病毒。新型冠状病毒肺炎虽然是自限性疾病，但有一定的致死率，且该病毒为传染性极强，至今尚无有效疫苗和治疗方法。目前预防该病毒感染最行之有效的手段就是隔离与消毒[4]。

目前，常用84消毒剂和酒精是单方消毒剂，但日常生活中使用84消毒剂会导致一定的漂白及腐蚀性，酒精在封闭环境中使用具有一定危险性。兽用消毒剂很多是复方消毒剂，为了评估这些消毒剂对于冠状病毒是否有效，同时在消毒剂评估上掌握一种替代的评价方法，此研究建立了以冠状病毒-猪流行性腹泻病毒（PEDV）为指示病毒的评价模型，重点评估消毒剂最低有效浓度和最短作用时间，以期为冠状病毒的消毒剂评估提供了一种可行和敏感的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株

Vero-E6细胞和纯净稳定传代PEDV（ZJ08株）毒株均由天津瑞普生物技术股份有限公司研究院馈赠。

1.2 待测消毒剂

安立消（月苄三甲氯铵，双链季铵盐）、卫清宁（过硫酸氢钾复合物粉 含氯≥10%）、新欧福（戊二醛-葵甲溴铵）、二氯异氰脲酸钠（含氯20%）、84消毒液（含氯4.5%）、酒精。

1.3 实验方法

1.3.1 最大无毒浓度摸索

将各种消毒剂用细胞维持液按照100倍稀释后接种铺满Vero-E6细胞的细胞板，观察细胞变化，无细胞变化的最小稀释度为该消毒剂的最大无毒浓度。

1.3.2 最低有效浓度（病毒灭活率）测定

将消毒剂从1.3.1中最大无毒浓度开始进行100系列稀释，与病毒液进行等体积混合，室温下静置30 min使消毒剂与病毒液充分作用。作用完后，加入相应中和剂终止实验，将混合物用含2%胎牛血清的DMEM培养液进行10倍梯度稀释，测定TCID50，同时作无消毒剂、无病毒的空白对照；取长满Vero-E6细胞单层的96孔细胞板作原病毒对照板，测定与消毒剂作用前病毒液TCID50；另设75%乙醇做消毒剂对照。将接种后的96孔细胞板置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，连续观察120 h，分别计算有消毒剂和无消毒剂的TCID50，计算病毒灭活率和消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

病毒灭活率%=（消毒前病毒滴度-消毒后病毒滴度）/消毒前病毒滴度 100%

1.3.3 最短作用时间测定

将消毒剂稀释到1.3.2中测定最低有效浓度的中间浓度，与病毒液进行等体积混合，室温下分别静置1 min、5 min、10 min使消毒剂与病毒液充分作用。作用完后，加入相应中和剂终止实验，将混合物用含2%胎牛血清的DMEM培养液进行10倍梯度稀释，测定TCID50，同时作无消毒剂、无病毒的空白对照。另取长满Vero-E6细胞单层的96孔细胞板作原病毒对照板，测定与消毒剂作用前病毒液TCID50。将接种后的96孔细胞板置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，连续观察120 h，分别计算有消毒剂和无消毒剂的TCID50，计算消毒前后病毒下降滴度Log10TCID50/100μL。

1.3.4 判定标准

实验结果判定标准为：消毒后滴度下降≥104即为有效。

2 实验结果

2.1 最低有效浓度

新欧福最低有效浓度为1:500；安立消最低有效浓度为1:800；卫清宁最低有效浓度为1:1 600；二氯异氰脲酸钠的最低有效浓度为1:1 000；84消毒液最低有效浓度为1:100。具体实验结果见表1。

2.2 最短作用时间测定

含氯制剂二氯异氰脲酸钠粉、84消毒液、卫清宁（主要成分为过硫酸氢钾复合粉）与病毒作用1 min后，为毒价降低106.5，能够有效杀灭猪病毒性腹泻病毒PEDV，季铵盐类消毒剂安立消和醛类消毒剂新欧福、酒精最短作用时间>10 min，需要更长的时间才能杀灭病毒。不同作用时间消毒效果详见表2。

3 讨论

新型冠状病毒COVID-19与SARS病毒以相同的方式进入宿主细胞，与蝙蝠相关病毒基因组测序相似型达87.1%，属于SARS相关冠状病毒。但传染性与致病性均高于2003年SARS病毒[5]，截止本文发稿前，该病毒导致的确诊病例达超7万多例，还有疑似5万多例，累计死亡超过2 600例，感染和死亡人数远远超过SARS病毒。

根据新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第6版）规定，COVID-19病毒属于β属冠状病毒，乙醚、酒精、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等均能有效杀灭病毒。有专家指出有效消毒是保证猪场生物安全的必要手段[6]。王成新认为，有效消毒必须选择适用的消毒剂，必须针对不同的消毒对象采用不同的方法。此研究中，将84消毒剂、酒精和常见兽用复方消毒剂建立了一种利用Vero-E6细胞进行消毒效果评估[7-8]，利用细胞将PEDV-ZJ08株作为指示病毒，通过进行消毒前后病毒效价测定对比，对消毒剂杀灭冠状病毒的效果进行评估的模型。这种方法比其他消毒剂评价方式更加敏感，且可专门针对冠状病毒进行消毒剂评估，在新冠疫情期间猪场人员、环境消毒非常具有指导意义。

表1 不同类消毒剂感作30 min时的最低有效浓度

表2 不同类消毒剂与病毒作用不同时间病毒滴度的降低值

共测定6种消毒剂，其中安立消（月苄三甲氯铵，双链季铵盐）、卫清宁（过硫酸氢钾复合粉）、二氯异氰脲酸钠粉、84消毒液均为含氯消毒剂；新欧福（戊二醛-葵甲溴铵）为醛类消毒剂；75%乙醇为醇类消毒剂。根据实验结果分析，所测消毒剂均能有效杀灭冠状病毒，但不同消毒剂有效的最低有效浓度有差异，最短作用时间结果显示，含氯消毒剂对于杀灭冠状病毒效果迅速，可在1 min内迅速杀灭PEDV，而其他种类消毒剂作用超过10 min才能达到杀灭冠状病毒的效果。卫清宁（过硫酸氢钾复合粉）消毒效果明显优于其他消毒剂。84消毒剂的最大稀释到1:100倍可以使PEDV病毒下降104，卫清宁最大稀释倍数为1:1 600时，仍然可以有效杀灭冠状病毒，与84消毒剂相比较，卫清宁是84消毒液效果的16倍。二氯异氰脲酸钠粉是84消毒剂消毒效果的10倍，这可能与二者有效含氯量有关，前者有效含氯量为20%，后者有效含氯量为4.5%，而卫清宁（过硫酸氢钾复合粉）有效含氯量≥10%，除氯制剂起作用外，还与其溶于水后产生氧化性和酸性有关。

由于新型冠状病毒COVID-19具有高度传染性，许多生物实验室的等级不够，不能直接进行该病毒的研究，但在消毒剂评价时，常可以借用指示消毒效果的替代病毒或指示病毒。在2002年版《消毒技术规范》中[9-10],规定可以脊髓灰质炎病毒1型疫苗株和艾滋病毒1型美国株悬液定量灭活试验作为指示病毒,来分别代表肠道致病病毒和艾滋病病毒。新型冠状病毒COVID-19可在Vero-E6细胞上进行增殖[11]。而猪流行性腹泻PEDV属于冠状病毒科[6]，其中ZJ08株是能稳定传代的疫苗株，在Vero-E6细胞上有明显特征性细胞病变，操作简便，安全且具有良好的稳定性，可作为冠状病毒科新型冠状病毒的指示病毒。

卫清宁主要成分为过硫酸氢钾复合粉有效含氯量≥10%，不受有机物影响，适合不同条件下环境、水体等消毒，最终代谢产物为氯化钠和二氧化碳，属于低毒产品，对环境及人体无害，且根据报道，研究人员对过硫酸氢钾消毒剂产品已做过很多研究，对多种病毒和细菌孢子等具有杀灭作用，可适用于猪场环境及人员、水体消毒和家庭日常消毒及泳池水体消毒等，是一种安全高效环保消毒剂。[12-15]