榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞的作用机制探析

苏春晓，白静慧

(辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032)

榄香烯(β-Elemene)是一种从姜黄(CurcumazedoariaRoscoe)中提取的倍半萜烯化合物，一般用于中药(TCM)治疗，可通过调节不同的通路治疗肺癌在内的多种肿瘤，包括肝癌、乳腺癌、胃癌等[2]。有文献[1]详细总结了榄香烯在中药抗肿瘤方面的重要作用，而近年来关于榄香烯的研究也进一步证实了榄香烯的抗癌作用，如近期某项研究发现，榄香烯在肿瘤的传统联合治疗中，具有增敏靶向治疗的作用，可增强A549细胞对靶向药物的吸收[3]。但是目前，对于榄香烯用药的确切浓度以及最佳时间的选择仍然比较模糊。本研究通过观察β-榄香烯作用于人NSCLC细胞系A549细胞增殖、细胞周期以及细胞凋亡的影响，探讨β-榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞的作用机制，进而分析榄香烯作用于A549细胞系时的最适浓度以及时间。

1 实验材料

1.1 细胞株

本研究所用人NSCLC细胞系A549细胞株，由辽宁省肿瘤医院中心实验室提供。

1.2 药材和试剂

榄香烯(购于上海复祥生物科技有限公司)；1640完全培养液(购于 HyClone公司)，加入10%胎牛血清(购于上海逸研生物科技有限公司)；5%双抗(青霉素和链霉素)购于 HyClone公司；PBS购于 HyClone公司；胰蛋白酶消化液购于北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂购于中国碧云天生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购于中国碧云天生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养

取实验用人NSCLC细胞系A549细胞，加入含10%胎牛血清、5%双抗的1640完全培养基中培养，然后将细胞放入环境为37 ℃、CO2体积分数为5%的孵箱中培养，1～2天换1次液，2～3天传代1次。以上实验均在细胞对数生长期进行。

2.2 榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞增值的影响

实验分为空白组(只加1640完全培养液)和对照组(加入完全培养液)。浓度为10、20、40、80、160 μg/mL各1组，每组设 3个复孔。取对数生长期人NSCLC细胞系A549细胞接种于96孔板中(每孔7×103个细胞)，过夜后吸除培养液。空白组和对照组分别加入1640完全培养基，其余各组分别加入浓度为10、20、40、80、160 μg/mL的榄香烯药液，分别培养24 h、48 h、72 h后，吸除培养液和药液后，每孔加入0.1 mL CCK-8试剂，避光，继续培养40 min，利用全自动酶标仪测定各孔D(450)值，观察空白组以便于排除因其他因素对实验结果的干扰，后按公式：细胞抑制率(%)=[D(450)对照组-D(450)实验组]/D(450)对照组×100%，计算细胞抑制率。使用SPSS软件，计算IC50。

2.3 榄香烯对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

实验设为对照组和浓度为 10、20、40、80、160 μg/m的各一组，共6组，取对数生长期的人NSCLC细胞系A549细胞，以每孔5×105个细胞铺于孔板中，培养 24 h后，分别加入浓度为10、20、40、80、160 μg/mL的榄香烯药液，放置于环境为37 ℃、CO2体积分数为5%的孵箱中，48 h后取出，分别用胶头滴管吸取上清液于1.5 mL的EP管中，4 ℃离心，使细胞沉到管底，吸取上清液并丢弃，可留50 μL培养液，以免吸走细胞。加入1 mL提前遇冷的PBS，重悬细胞，移到1.5 mL无菌离心管，4 ℃离心，使细胞沉底。小心吸取上清液并丢弃，可留50 μL PBS，以免吸走细胞。轻弹离心管以分散细胞，避免成团。细胞固定：加入1 mL冰浴预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4 ℃固定2 h(12～24 h效果更佳)。细胞清洗：4 ℃离心，使细胞沉到管底。吸取上清液并丢弃，留50 μL溶液，以免吸走细胞。加入1 mL提前预冷的PBS，重悬细胞，移到1.5 mL无菌离心管。4 ℃离心，使细胞沉底。吸取上清液并丢弃，可留50 μL PBS，以免吸走细胞。PI染色：在每个细胞样品中加入500 μL配置好的PI工作液，轻轻重悬细胞沉淀，置于37 ℃避光水浴30 min。检测分析：用流式细胞仪在488 nm条件下检测分析细胞凋亡率。以上实验重复3次。

2.4 榄香烯对肺腺癌A549细胞周期的影响

采用碘化丙啶(PI)标记流式细胞仪检测细胞周期：将人NSCLC细胞系A549细胞接种于24孔板，分组及药物处理同“2.2”项，在环境为37 ℃、CO2体积分数为5%的孵箱中培养24 h，吸出上清液，用胰酶将细胞消化吹打，制成细胞悬液，用胶头滴管移至EP管，以2 000 r/min、20 ℃，离心10 min，用4 ℃预冷后的75%乙醇固定，4 ℃避光过夜。次日取出，以2 000 r、20 ℃，离心10 min，清洗2次(第一次用PBS，第二次用染色液)。将细胞重悬于0.5 mL PI染色液中，4 ℃避光染色 30 min。采用流式细胞仪分析染色细胞各周期的百分率。以上实验重复3次。

3 结果

3.1 β-榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞增殖的影响

经CCK-8法检测，SPSS分析可知：榄香烯作用于A549细胞48 h与72 h的IC50分别为167.40 μg/mL和104 μg/mL。

在作用时间为24 h、48 h、72 h的条件下，人NSCLC细胞系A549细胞的抑制率，随浓度在10～160 μg/mL范围内的β榄香烯的作用呈浓度性依赖，且每个时间段均具有统计学差异；不过在10～20 μg/mL浓度段无统计学差异(P>0.05)，其他浓度段均有统计学差异(P<0.05)。见表1、图1。

组别24h48h72h10μg/mL5.04±0.1212.56±0.7017.87±0.8520μg/mL6.66±0.4216.49±0.6321.50±0.9740μg/mL7.69±0.4220.65±1.3030.72±0.7680μg/mL25.31±0.5733.33±1.3640.30±0.19160μg/mL43.45±0.5653.45±1.1663.05±1.33

图1 榄香烯对A549细胞增值的抑制作用

3.2 β-榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞周期的影响

经分析，G2/M期各浓度与对照组相比，只有40 μg/mL与80 μg/mL具有统计学差异(P<0.05)；与24 h相比，48 h及72 h的G2/M期细胞比例明显下降(P<0.05)，sub-G1期明显上升；与对照组比较，只有40 μg/mL与80 μg/mL具有统计学差异(P<0.05)；与24 h相比，48 h和72 h均具有统计学差异(P<0.05)，但48 h与72 h之间无统计学差异(P>0.05)。见表2、图2。

3.3 β-榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞凋亡的影响

与对照组相比，浓度为10 μg/mL和浓度为20 μg/mL的组无统计学差异(P>0.05)，其他各组均具有统计学差异(P<0.05)。组间比较，24 h、48 h、72 h间亦均具有统计学差异(P<0.05)；与对照组相比，A549细胞凋亡率随榄香烯作用浓度的增高亦有升高趋势。见表3、图3。

组别周期24h48h72h0μg/mLG2/M期15.60±0.3515.67±0.4515.43±0.39Sub-G1期0.78±0.080.72±0.020.77±0.0310μg /mLG2/M期15.74±0.2012.66±0.4412.43±0.47Sub-G1期0.72±0.051.55±0.061.65±0.0620μg/mLG2/M期15.27±0.2012.32±0.5011.97±0.58Sub-G1期0.76±0.052.29±0.462.35±0.7240μg/mLG2/M期15.86±0.297.77±0.577.64±0.39Sub-G1期0.73±0.044.71±0.465.41±0.3580μg/mLG2/M期15.67±0.517.50±0.436.59±0.54Sub-G1期0.73±0.026.32±0.497.33±0.43160μg/mLG2/M期15.68±0.2612.38±0.5310.44±0.48Sub-G1期0.67±0.022.45±0.522.72±0.48

图2 榄香烯对A549细胞周期的影响

组别24h48h72h0μg/mL0.15±0.050.18±0.020.19±0.0210μg/mL1.11±0.303.37±1.508.54±1.1620μg/mL1.44±0.554.70±1.6710.65±1.4240μg/mL1.43±0.659.50±1.9416.54±2.2480μg/mL3.78±1.2017.09±2.2422.74±2.38160μg/mL7.20±1.6219.04±2.8031.26±3.00

图3 榄香烯对A549细胞凋亡的影响

3 讨论

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，约占全部癌症患者的11.6%，同时也是癌症相关死亡的主要原因，约占全部癌症死亡病例的18.4%[4]。70%以上的患者在首次诊断为肺癌时就已经是晚期，肺癌的5年生存率不足20%[5]。临床上，肺癌是发病率较高的恶性肿瘤，手术是治疗肺癌的主要方式，术后患者需要接受常规化疗治疗，化疗通常伴随较为严重的毒副反应，如纳呆、恶心呕吐、情绪焦躁、便秘等，给患者生理、心理造成很大程度的伤害[6]。榄香烯是国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物，由中药温郁金提炼而来，在临床上广泛应用于癌症的治疗[7]。榄香烯不仅可以提高癌症的临床疗效，还能增强患者的细胞免疫功能，减轻化疗的毒副作用[8]。故榄香烯在临床治疗癌症中有重要作用，需进一步加强对于其深层次的研究，以造福患者。

4 结论

本实验通过探究榄香烯对人NSCLC细胞系A549细胞的作用机制，进一步明确了榄香烯作用于细胞的相对有效时间与最佳作用浓度，为今后非小细胞肺癌患者的临床用药提供了有益借鉴。