星点设计-响应面法优化大黄中大黄素的匀浆提取工艺研究

古炳明

(梅州市食品药品监督检验所，广东 梅州 514071)

大黄是中国传统的中药，收载于2015版《中国药典》一部，来源于寥科植物掌叶大黄palmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim，ex Balf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎[1]。据统计，关于大黄主要活性物质的研究中对蒽醌类成分的研究最多，蒽醌类成分的平均总量约为3%～5%，以游离型蒽醌类和结合型蒽醌类两种形式存在[2-3]。在2015版《中国药典》中，大黄含量测定采用以甲醇作为溶剂，回流1h的方法对蒽醌类成分进行提取，此法操作较繁琐，耗时较长，工作效率较低。高速匀浆法是先将物料与提取溶剂混合后，利用匀浆仪内流体力学和高速机械剪切刀的工作，将物料研磨成均匀的糊状物，从而达到粉碎与提取有效成分的目的[4]。此方法粉碎效果好，具有工作效率高、能耗低、经济环保等优点。目前关于高速匀浆法提取大黄蒽醌类成分的工艺研究未见报道，本实验旨在利用星点设计效应面法找寻一种节能、高效、操作便利的提取工艺以提高工作效率，现将实验过程报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪；Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；Sartorius BP211D电子分析天平(十万分之一)；AB204-N电子分析天平(万分之一)；ULUP-I-10T纯水系统；IKA高速匀浆机；IKA中药材粉碎机。

1.2 试药与试剂

大黄素(批号：110756-200110，由中国药品生物制品检定所提供)；大黄(批号：17040910，安徽协和成药业饮片有限公司)；甲醇(批号：503332-08444，天津市四友精细化学品有限公司出品，河北四友卓越科技有限公司制造)，磷酸(批号：20160520，天津市科密欧化学试剂有限公司)均为色谱纯；水为超纯水；甲醇(批号：20170301-2，广州化学试剂厂)，乙醇(批号：20170702-2，广州化学试剂厂)，乙酸乙酯(批号：20161201-2，广州化学试剂厂)均为分析纯。试验用大黄均经梅州市食品药品监督检验所陈繁华副主任中药师鉴定为药典来源大黄。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱：(4.6 mm×250 mm，5 μm，SN：USCL054036)；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温箱温度为30 ℃；进样体积10.0 μL，理论塔板数按大黄素计算应不少于3 000[1]。

2.2 对照品溶液的制备

取大黄素对照品10.85 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取8 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即可得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取大黄粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置烧杯中，精密加入甲醇25 mL，提取3 min，转速10 000 r/min，滤过，取续滤液，即可得供试品溶液。

2.4 对照品及样品测定

分别按“2.1.2”“2.1.3”项下方法制备对照品、供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析。见图1 。

注：1．大黄素

2.5 单因素试验

2.5.1 提取溶剂对有效成分的影响 取大黄粉末(过四号筛)，精密称取3份各0.5 g，分别精密加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯各25 mL，匀浆3 min，转速10 000 r/min，滤过，取续滤液，即得。测定大黄素含量，平行6次，求平均值。甲醇提取的大黄素含量最高。

2.5.2 匀浆转速对有效成分的影响 取大黄粉末(过四号筛)，精密称取6份各0.5 g，精密加入甲醇25 mL，匀浆3 min，转速分别为6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min、12 000 r/min、14 000 r/min、16 000 r/min，滤过，取续滤液，即得。测定大黄素含量，平行6次，求平均值。当匀浆转速为10 000r/min时，大黄素含量最高。

2.5.3 匀浆时间对有效成分的影响 取大黄粉末(过四号筛)，精密称取6份各0.5 g，置烧杯中，精密加入甲醇25 mL，转速10 000 r/min，匀浆提取时间分别为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，滤过，取续滤液，即得。测定大黄素含量，平行6次，求平均值。当匀浆时间为4 min时，大黄素含量最高。

2.5.4 溶剂体积对有效成分的影响 取大黄粉末(过四号筛)，精密称取9份各0.5 g，分别精密加入甲醇10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45 mL、50 mL，提取4 min，转速10 000 r/min，滤过，取续滤液，即得。测定大黄素含量，平行6次，求平均值。当甲醇体积为40 mL时，大黄素含量最高。

2.5.5 溶剂体积分数对有效成分的影响 取大黄粉末(过四号筛)，精密称取6份各0.5 g，分别精密加入体积分数为50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇40 mL，提取4 min，转速10 000 r/min，滤过，取续滤液，即得。平测定大黄素含量，平行6次，求平均值。当甲醇体积分数为80%时，大黄素含量最高。

2.6 星点设计试验优化大黄中大黄素匀浆提取工艺

2.6.1 星点设计 经单因素考察确定溶剂为甲醇，以匀浆转速、时间、甲醇体积及甲醇体积分数(%)为考察因素，以大黄素含量为响应值，每个因素设5个水平，并以-2、-1、0、1、2表示自变量的水平高低，按表1方案试验，结果见表2。

表1 匀浆提取星点设计因素及水平

表2 匀浆提取大黄中大黄素试验设计及结果

2.6.2 结果分析 采用Design-Expert 8.0.5软件对表2结果进行处理，以匀浆转速(A)、时间(B)、甲醇体积(C)和甲醇体积分数(D)为自变量，大黄素含量(Y)为响应值进行线性及多项式拟合，根据P值和r值来判定模型的好坏。对其进行模型拟合分析，可得二项式拟合方程：

Y=-0.40 998+5.97 917×10-6A+0.031 542B-3.51 667×10-3C+0.012 288D-3.12 500×10-7AB+5.00 000×10-8AC-5.62 500×10-8AD-1.50 000×10-4BC-1.37 500×10-4BD-2.50 000×10-5CD-3.64 583×10-11A2-1.02 083×0-3B2+6.41 667×10-5C2-6.02 083×10-5D2(P<0.05，r=0.8 897)

其模型项P<0.05，提示Y与A、B、C、D回归关系显著，失拟项P>0.05，提示其他未知因素对实验结果的干扰较小，模型相关系数r=0.8897，模型可信度高，此方程与实际情况拟合较好，可对大黄中大黄素的匀浆提取工艺进行较好预测。A、B及D均P<0.05，提示上述因素对提取大黄中的大黄素影响显著。各因素对提取大黄中的大黄素的影响顺序为：甲醇体积分数>匀浆时间>匀浆转速>甲醇体积。

2.6.3 效应面优化和预测 根据回归方程，在保持2个因素编码值为0时，再对其他两个因素进行分析，通过Design-Expert 8.0.5软件绘制大黄素含量与4个自变量的等高线图及三维响应面图，见图2、图3。

图2 各因素对匀浆提取大黄素的等高线

图3 甲醇体积分数、甲醇体积对匀浆提取大黄素的响应面

从图2可看出，各因素之间的等高线图不是趋向于椭圆，表明它们之间的交互作用影响不明显；由图3可知，甲醇体积分数的曲面较陡峭，说明甲醇体积分数对大黄素含量的影响最大，随着甲醇体积分数增加，大黄素含量也逐渐增加，当甲醇体积分数上升到82%～85%时，大黄素含量达到了最大值，之后随着甲醇体积分数的增加，大黄素含量也逐渐下降。

2.6.4 条件优化及验证试验 以Design-Expert 8.0.5软件预测分析，得出匀浆提取最佳工艺为：转速为11 999.99 r/min，时间为5 min，甲醇体积为35 mL，甲醇体积分数为83.5%，在此条件下预测出大黄素含量为0.139%。根据实际，最终确定最佳提取工艺为：转速为12 000 r/min，时间为5 min，甲醇体积为35 mL，甲醇体积分数为83.5%，按此提取工艺条件提取大黄中的大黄素，平行试验3次，结果见表3，实测值与理论预测值间相对误差RE均在5%以下，提示本研究优化的匀浆提取大黄中大黄素的提取条件参数准确可靠。

表3 星点设计-效应面法优化处方验证试验结果

注：相对误差RE=(预测值-实测值)/预测值×100%。

2.7 高速匀浆提取与回流提取效果对比

以2号样品分别精密称取0.5 g各6份，按《中国药典》一部下提取方法与本研究优化后的提取方法进行提取后，以HPLC法对大黄素含量进行测定，计算RSD值为1.39%。

3 讨论

大黄游离蒽醌类成分在甲醇、乙醇、乙酸乙酯中均可溶，故选择上述溶剂进行考察，发现甲醇提取大黄素的含量最高，乙醇次之，乙酸乙酯最低，且从色谱图上发现乙酸乙酯提取的游离蒽醌类成分不完全。本研究选取提取溶剂体积、体积分数、转速及匀浆时间4个参数进行优化。在提取溶剂体积方面，体积过少无法充分地浸润物料，使目标成分溶解受限。但本研究单因素发现甲醇体积达40 mL后，随着甲醇体积的增加，目标成分含量开始下降。可能因溶剂过多匀浆转头与物料接触不够充分，物料粉碎不足而使目标成分溶出不全。在溶剂浓度方面，随着甲醇浓度增大，大黄素含量逐渐升高，提示适量的水分可促进溶剂浸入细胞内部，可更好地溶解目标成分而在一定程度上提高提取效率。在甲醇浓度达到80%之后，随着甲醇浓度的增大，大黄素的含量呈下降趋势，可能与此时提取溶剂中水的比例下降，极性相应有所下降，在此极性范围内不适宜目标成分的溶解。理论上来说转速越大，物料粉碎效果越好，目标成分提取效率越高，但转速过大时可能导致目标成分结构被破坏而使含量不升反降。本研究发现在转速为16 000 r/min时，大黄素含量明显下降，可能与过大的转速破坏了大黄素的结构有关。匀浆时间越长，物料粉碎越充分，大黄素含量理论上应有所提高，但在单因素分析时发现匀浆时间增加到4 min之后，随着匀浆时间的增加，大黄素含量反而下降，可能随着时间增加物料过度粉碎，使匀浆液黏度增加，滤过时单位时间内通过的目标成分量下降而使其含量下降。因大黄中大黄素提取受上述因素的综合影响，故在单因素分析的基础上进行星点设计-响应面法优化提取工艺，以分析各因素综合作用的影响[5]。