盐酸厄洛替尼基因毒性杂质液相色谱-质谱联用分析方法学验证

刘兰畦，赵燕芳，谢含仪，王珊珊，陈相峰

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省分析测试中心, 山东 济南 250014)

中国现阶段人口老龄化发展十分迅速，越来越多的人口步入老年。随着环境污染和生活压力的加剧，老年人肺癌的发病率不断增加[1-2]。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人们健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[3-4]。肺癌的治疗方法除了传统的手术，还有化疗、靶向治疗、免疫治疗以及中药治疗等。以靶向治疗为例，治疗的药物需要经过严格的基因检测，找到合适的突破靶点后才选择合适的靶向药物。盐酸厄洛替尼[5-7]又称特罗凯，是一种分子靶向治疗晚期非小细胞肺癌的药物，盐酸厄洛替尼片通过抑制人体细胞内表皮生长因子上一种特定酶的活性从而达到抑制肿瘤生长的作用，对提高患者的带瘤生存率和改善生存质量有很好的治疗效果[8-11]。但是老年肺癌患者由于脏器功能衰退、代谢功能降低和其他疾病的增多，对药物伴随毒副反应耐受性较差，需要对患者所服用的靶向药物进行基因毒性杂质检测，来避免对服药患者的二次伤害。基因毒性杂质是指能直接或间接损害DNA、引起基因突变或致癌的一类物质，盐酸厄洛替尼在生产和储藏过程中引入的杂质存在着一定的毒副反应[12-14]，给患者治疗造成不良影响，有必要对其加以严格控制[15-18]。本文研究并建立了采用液相色谱-质谱联用法测定盐酸厄洛替尼片中基因毒性杂质3-乙炔苯胺含量的方法，毒理学限值小于10×10-6[19]，能够有效地用于对其中3-乙炔苯胺的质量控制。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

QTRAP 5500型三重四极杆串联质谱仪、Thermo UltiMate 3000液相系统、Thermo Hypersil GOLD C8色谱柱(美国Thermo公司) ；KQ2202 型数控超声波清洗机(上海楚柏实验设备有限公司)；Mettle AB265-S 型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 实验材料

对照品3-乙炔苯胺纯度98%(上海时代生物科技有限公司)；甲醇为色谱纯(美国天地有限公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；盐酸厄洛替尼片(上海罗氏制药有限公司)。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C8(100 mm×4.6 mm，3 μm)，进样量，5 μL ，柱温，35 ℃，流速，0.4 mL/min。流动相为甲醇和水，梯度洗脱：0～2 min，20%甲醇；2～6 min，95%甲醇；6～9.5 min，95%甲醇；9.5～12 min，20%甲醇。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，多反应监测(MRM)模式，正离子检测，选择离子对118→75、118→91；离子源喷射电压5500 V，气帘气体(CUR)压力40 psi(1 psi=6.895 kPa)，碰撞气体(CAD)压力Medium，温度600 ℃，雾化气(GAS1)压力45 psi，辅助气(GAS2)压力50 psi，去簇电压(DP) 40 eV，碰撞能量(CE) 37 eV。

2.3 溶液的制备

供试品溶液的制备：取供试品盐酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，过500目筛，精密称定5.0 mg，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，超声2 min，即得。

对照品贮备液的制备：取3-乙炔苯胺对照品，精密称定100.0 mg，置100 mL量瓶中，加入少量甲醇使其溶解，然后用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1 mL含1 mg的3-乙炔苯胺的溶液。取上述溶液用甲醇逐级稀释成浓度为1 mL含100 ng的3-乙炔苯胺溶液，配制100 mL，即得。

对照品溶液的制备：取对照品贮备液5.0 mL，精密量取，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1 mL含5 ng的溶液，即得。

3 分析方法验证

3.1 专属性验证

取甲醇试剂作为空白溶液、供试品溶液质谱进样，证明空白溶液、供试品溶液对被测物测试无干扰；并取供试品含杂质的混合溶液进样。相应的二级全扫描质谱图见图1。结果表明，空白溶液、供试品中其他杂质对目标化合物的检测无干扰，方法专属性强。

图1 对照品溶液、供试品溶液及供试品含杂质溶液的提取离子流色谱图Fig.1 Extraction ion chromatograms for the control solution, test solution, and test product solution with the impurity

3.2 定量限及检测限验证

信噪比(S/N)在3～5的浓度为检测限浓度，信噪比在10～15的浓度为定量限浓度，计算定量限浓度6针对应的信噪比的相对标准偏差(RSD)应小于等于10.0%。

精密移取对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成0.5 ng/mL的溶液，作为检测限验证浓度。

精密移取对照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成1 ng/mL的溶液，作为定量限验证浓度。测试结果见表1、表2。

表1 检测限实验结果

表2 定量限实验结果

结果显示：该分析方法中3-乙炔苯胺的检出限为1.0×10-6；3-乙炔苯胺的定量限为2.0×10-6，其定量限6针信噪比的相对标准偏差为6.08%，且小于10%。

3.3 线性范围验证

取对照品贮备液适量，分别用甲醇溶液逐级稀释配制成浓度为1、2、5、6、10、20 ng/mL 的标准溶液，作为线性范围验证溶液。取上述溶液各5 μL进样，记录色谱图。

结果显示，该分析方法中3-乙炔苯胺在1.0～20.0 ng/mL 的质量浓度范围内，线性方程为y=23 983.3x-5 594.8，线性相关系数R2= 0.999 4，呈现出良好的线性关系。

3.4 方法精密度验证

取对照品溶液作为方法精密度测试溶液，连续重复进样6次，记录峰面积响应值,并计算相对标准偏差。结果显示该分析方法中3-乙炔苯胺峰面积的相对标准偏差为1.13%，证明方法精密度高。

3.5 重复性验证

取盐酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密称定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精确加入0.5 mL 3-乙炔苯胺对照品贮备溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，超声2 min，配制成含3-乙炔苯胺标准限度值为100% 浓度的测试溶液，作为重复性测试溶液，平行6份，各取5 μL进样，记录浓度测定值，并计算相对标准偏差，6份平行样品待测物实测浓度相对标准偏差为4.74%。结果显示，该分析方法中3-乙炔苯胺重复性好。

3.6 加标回收率验证

取盐酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密称定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精确加入0.4 mL 3-乙炔苯胺对照品贮备溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，超声2 min，配制成含3-乙炔苯胺标准限度值为80% 浓度的测试溶液，配制3份；取盐酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密称定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精确加入0.5 mL 3-乙炔苯胺对照品贮备溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，超声2 min，配制成含3-乙炔苯胺标准限度值为100% 浓度的测试溶液，配制3份；取盐酸厄洛替尼片，粉碎成粉末，精密称定5.0 mg，置10 mL量瓶中，再精确加入0.6 mL 3-乙炔苯胺对照品贮备溶液，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，超声2 min，配制成含3-乙炔苯胺标准限度值为120% 浓度的测试溶液，配制3份，作为回收率测试溶液。计算添加3-乙炔苯胺含量的回收率及回收率的相对标准偏差，验证测定结果与真实值的差异，来确定该分析方法能否获得准确的测试结果。3-乙炔苯胺加标回收测试结果见表3。

表3 3-乙炔苯胺回收率测试结果

结果显示，该分析方法中3-乙炔苯胺低、中、高的加标的回收率范围为90.1%～106.1%，回收率相对标准偏差为5.1%，回收率测试结果良好。

3.7 样品含量测定

将建立的方法学应用于对盐酸厄洛替尼片中基因毒性杂质3-乙炔苯胺的分析。分别取盐酸厄洛替尼片3个不同批次作为样品1、样品2、样品3，粉碎成粉末，过500目筛，精密称定5.0 mg，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，超声2 min后，各取5 μL进样。测定结果显示，样品1～3均未检出3-乙炔苯胺。经加标回收率实验，得到样品中回收率在87.5%～104.5%之间，回收率结果良好，可见该方法可以应用到实际样品的分析中。

4 结论

通过对上述各项指标的验证，表明采用液相色谱-质谱联用法测定盐酸厄洛替尼中的基因毒性杂质3-乙炔苯胺的分析方法，专属性强，灵敏度高，回收率好，方法准确、可靠，能够达到药物基因毒性杂质检测的技术要求。