EDNRB基因真核表达载体的构建及其对MCF-7细胞增殖的影响

刘立琨 刘得水 李新 岳丽玲 林悦铭 张微 周丽

[摘要] 目的 构建pCI2-EDNRB真核表达载体，探讨EDNRB过表达对MCF-7细胞增殖的影响。 方法 设计EDNRB基因特异性引物，应用PCR法扩增其编码序列，构建pCI2-EDNRB真核表达载体并转染MCF-7细胞，RT-PCR和Western blot分别检测EDNRB的mRNA和蛋白表达;MTT法检测EDNRB过表达后MCF-7细胞增殖能力。结果pCI2-EDNRB真核表达载体成功构建，MCF-7细胞中EDNRB的mRNA和蛋白水平均较对照组明显升高，过表达EDNRB抑制了MCF-7细胞的增殖。 结论 该研究成功构建了pCI2-EDNRB真核表达载体，过表达EDNRB可抑制MCF-7细胞增殖，这为深入研究EDNRB在乳腺癌中的功能及分子机制打下良好基础。

[关键词] 内皮素受体B;真核表达;MCF-7细胞;细胞增殖

[中图分类号] R736          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2020）01（b）-0026-03

Construction of EDNRB Gene Eukaryotic Expression Vector and Its Effect on Proliferation of MCF-7 Cells

LIU Li-kun1， LIU De-shui1， LI Xin2， YUE Li-ling1， LIN Yue-ming3， ZHANG Wei1， ZHOU Li1

1.Qiqihar Medical Institute of Pharmaceutical Sciences ，Qiqihar， Heilongjiang Province，161006  China; 2.Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College Breast Surgery，Qiqihar， Heilongjiang Province，161000  China; 3.Medical Technology School， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006  China

[Abstract] Objective To construct the eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB and investigate the effect of EDNRB overexpression on the proliferation of MCF-7 cells. Methods EDNRB gene-specific primers were designed and amplified by PCR. The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was constructed and transfected into MCF-7 cells. The mRNA and protein expression of EDNRB were detected by RT-PCR and Western blot， respectively. MTT assay The proliferation ability of MCF-7 cells after over-expression of EDNRB was examined. Results The eukaryotic expression vector of pCI2-EDNRB was successfully constructed. The mRNA and protein levels of EDNRB in MCF-7 cells were significantly higher than those in the control group. Overexpression of EDNRB inhibited the proliferation of MCF-7 cells. Conclusion The eukaryotic expression vector pCI2-EDNRB was successfully constructed in this study. Overexpression of EDNRB can inhibit the proliferation of MCF-7 cells， which lays a good foundation for further study of the function and molecular mechanism of EDNRB in breast cancer.

[Key words] Endothelin receptor B; Eukaryotic expression; MCF-7 cells; Cell proliferation

乳腺癌是一種异质性很强的恶性肿瘤，不同分子亚型的乳腺癌都有其自身的发生发展规律、生物学特点及预后风险。因此，寻找更具潜力的精准的分子靶标对于乳腺癌的治疗显得尤为重要。内皮素受体B（endothelin receptor B，EDNRB）是G蛋白偶联受体A家族成员，已有研究表明其在多种恶性肿瘤中异常表达，参与肿瘤的发生发展[1-4]。该研究拟构建EDNRB真核表达载体，并验证其对MCF-7细胞增殖的影响，为进一步研究EDNRB在乳腺癌发生发展中的功能和机制研究打下基础。

1  资料与方法

1.1  材料

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7购自中科院上海细胞库;MEM培养基购自Gibco公司;L-15培养基购自美国Hyclone公司;ExTaq DNA聚合酶、胶回收试剂盒、限制性内切酶KpnI、Sal I及T4 DNA连接酶购自Takara公司;反转录试剂盒、DH5α感受态细胞购自全式金公司;TRIzol、OPTI-MEM、LipofectaminTM3000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司;真核表达载体pCI2由齐齐哈尔医学院蛋白质结构与功能研究室惠赠。

1.2  方法

1.2.1  细胞培养MDA-MB-231细胞于含10%胎牛血清的L15培养基、37℃、无CO2的饱和湿度下培养，MCF-7细胞培养在含10μg/mL胰岛素、10%胎牛血清和1%的双抗（100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素）的MEM培养基中、于37℃、5% CO2条件下培养。

1.2.2  pCI2-EDNRB真核表达载体的构建从GeneBank中获取人EDNRB基因序列（NM_000115.4），借助Primer5.0软件设计基因特异性引物，上游和下游分别引入Kpn I和Sal I酶切位点。EDNRB上游引物：5'-CGGGGTACCATGCAGCCGCCTCCAAGTCT-3'，下游引物：5'-ACGCGTCGACCTTCTTTCAAGATGAGCTGTATT-3'。TRIzol法提取MDA-MB-231细胞中总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增EDNRB基因全长序列。Kpn I/Sal I内切酶对PCI2载体和EDNRB扩增产物双酶切，纯化连接后，转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定。

1.2.3  重组质粒pCI2-EDNRB瞬时转染  MCF-7细胞取对数生长期的MCF-7细胞，5×105/mL密度接种到6孔板，待细胞汇合度达到80%，按LipofectamineTM 3 000转染试剂盒说明书进行转染，转染空载体PCI2作为对照，24 h后提取各组细胞的RNA和蛋白进行mRNA和蛋白水平的鉴定。

1.2.4  RT-PCR检测 EDNRB mRNA水平的表达TRIzol法提取细胞总RNA进行RT-PCR，β-actin作为参照。EDNRB上游引物：5′-ACAAAGGAAGTT TCTGCGAATC-3′，下游引物：5′- CAGCAGAGGGCAAAGACAAG-3′;β-actin上游引物：5′-CGTGCGTGACATTAGGAGAG 3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTG

GAAGAGTG-3′。反应条件：42℃逆转录30min;95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环;72度延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.2.5  Western blot检测 EDNRB蛋白水平的表达重组质粒pCI2-EDNRB转染MCF-7细胞24 h后收集各组细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h。人兔抗EDNRB一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min后，羊抗兔IgG-HRP二抗室温孵育2 h，ECL显影。以GAPDH作为内参，Image Lab软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.6  MTT检测细胞增殖将生长良好的MCF-7细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞。细胞融合率达到80%，转染细胞，连续培养3 d，每天每组取3个平行孔细胞，加入MTT溶液（20 μL/孔），37℃孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO，于490 nm处检测每孔吸光值，以时间为横坐标，OD490 nm值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3  统计方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析， 计量资料用（x±s）表示，组间比较行t检验，计数资料用[n（%）]表示，组间比较行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  成功构建pCI2-EDNRB重组质粒

以MDA-MB-231细胞的cDNA为模板，PCR扩增EDNRB基因的编码区，结果显示在大约1 300 bp处有特异性扩增条带，片段大小与预期产物（1 329 bp）大小相符（图1A）。将重组质粒进行酶切鉴定，获得长约4 000 bp和1 300 bp的两条片段，符合预期结果。将阳性克隆进行测序，经NCBI BLAST比对，显示序列完全正确，说明pCI2-EDNRB表达载体成功构建（图1B）。

A. PCR扩增产物，M：DL2 000 DNA marker;1：EDNRB基因PCR产物。B. pCI2-EDNRB重组质粒双酶切鉴定，M：DL10 000 DNA marker;1：pCI2质粒;2：pCI2-EDNRB重组质粒;3：pCI2-EDNRB双酶切产物。

2.2  pCI2-EDNRB转染MCF-7细胞EDNRB的mRNA和蛋白水平上调

为了验证EDNRB能否在MCF-7细胞中正确转录，半定量RT-PCR检测EDNRB的mRNA表达。结果显示：与对照组相比，实验组中EDNRB的mRNA表达明显上调（图2A）。为了验证EDNRB能否在MCF-7细胞中正确翻译，以GAPDH为内参进行Western blot检测。结果显示，对照组EDNRB蛋白表达较弱，相对灰度值为0.195;而pCI2-EDNRB转染组中EDNRB蛋白表达明显增强，相对灰度值为0.810，两组间差异有统计学意义（P<0.01）。

A. RT-PCR检测EDNRB的mRNA表达，β-actin作为对照，M：DL2000 DNA marker;1：对照组;2：实验组。B. Western blot检测EDNRB的蛋白表达，GAPDH作为对照，1：对照组;2：实验组

2.3  EDNRB过表达抑制了MCF-7细胞增殖

用Lipofectamine 300 0介导pCI2-EDNRB重组质粒转染MCF-7细胞，分别于转染后0、24、48和72 h加入MTT检测。如图3所示，与对照组相比，pCI2-EDNRB转染可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，且随着时间延长，其抑制作用增强。

3  讨论

乳腺癌是一种来源于上皮细胞的恶性肿瘤[5]，其组织细胞具有高度异质性[6]，部分肿瘤容易发生耐药、复发和转移，目前在女性癌症相关死亡率高发位居第2位[7]。根据2015年St. Gallen会议提出的临床病理替代分子分型，将乳腺癌分为管腔A型（Luminal A type）、管腔B型（Luminal B type）、HER2过表达型（HER2-enriched type）及三阴性乳腺癌（Basal-like or triple-negative breast cancer，TNBC）等4种分子亚型[8]。后两种亚型预后较差，尤其是TNBC，预后最差。因此，对于不同分型和组织学分级的乳腺癌诊治及预后仍需要精准的分子靶标。

越来越多的研究指出EDNRB在许多人类恶性肿瘤中呈现低表达状态，参与癌症的发生发展进程。Zhou等[1]发现EDNRB在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中的表达较对照组明显下调。吴川清等[2]发现EDNRB在胃癌SGC-7901细胞中因高甲基化而表达缺失，5-Aza-CdR诱导EDNRB重新表达后抑制了SGC-7901细胞的增殖。牟童等[3]发现EDNRB在肝癌组织和SMMC-7721、Huh7细胞中表达均低于对照组，EDNRB过表达抑制了SMMC-7721和Huh7細胞的侵袭和迁移。刘立琨等[4]发现EDNRB在乳腺癌MCF-7和ZR-75-1细胞中因启动子区CpG岛高甲基化而表达缺失。这些结果均提示，EDNRB异常表达与癌症的发生发展进程密切相关，其有望成为癌症诊治与预后的新靶点分子，但其如何调控癌症的发生发展进程尚未见文献报道。

综上所述，该研究选取乳腺癌细胞作为实验模型，通过重组DNA技术构建了真核表达载体pCI2-EDNRB，经酶切和测序鉴定后转染MCF-7细胞，RT-PCR和Western blot结果证实EDNRB的mRNA和蛋白表达均较对照组高表达，进一步的功能研究显示过表达EDNRB的MCF-7细胞的增殖能力明显受到抑制。因此，该文推测EDNRB在乳腺癌中具有抑癌作用。这为进一步研究EDNRB在乳腺癌发生发展中的作用及分子机制提供理论支持。

[参考文献]

[1]  Zhou L， Feng X， Shan W， et al. Epigenetic and genetic alterations of EDNRB gene in nasopharyngeal carcinoma[J].Oncology， 2007，72（5-6）：357-363.

[2]  吴川清， 韩高雄， 帅晓明， 等. 5-氮杂-2-脱氧胞苷对人胃癌SGC-7901细胞株生长及EDNRB基因启动子异常甲基化的影响[J].世界华人消化杂志， 2010，18（36）：3843-3847.

[3]  牟童.肝细胞癌中关键基因与microRNA的交互作用分析及EDNRB基因对肝癌细胞的作用研究[D].重庆：重庆医科大学，2017.

[4]  刘立琨，朱文斌，刘得水，等.4株乳腺癌细胞中内皮素受体B基因的甲基化状态及对MCF-7细胞增殖的影响 [J].解剖学报，2018，49（5）： 611-616.

[5]  陈琛，谢长宽，冯江涛.乳腺癌肿瘤标志物在分子诊断中的作用 [J].世界最新医学信息文摘，2018，18（68）：109-110.

[6]  Oltmann J， Heselmeyer-haddad K， Hernandez LS， et al. Aneuploidy， TP53 mutation， and amplification of MYC correlate with increased intratumor heterogeneity and poor prognosis of breast cancer patients[J].Gene Chromosome Canc， 2018， 57（4）：165-175.

[7]  Siegel RL， Miller KD， Jemal A. Cancer statistics， 2017[J]. CA-cancer J Clin， 2017，67（1）：7-30.

[8]  邵志敏， 李俊杰. 2015年St.Gallen国际乳腺癌研讨会乳腺癌新的诊疗理念[J]. 中华乳腺病杂志：电子版，2015，9（2）：73-77.

（收稿日期：2019-10-22）

[基金项目] 黑龙江省教育厅科学技术研究项目（2016-KYYWF-0863）

[作者简介] 刘立琨（1982-），女，黑龙江双城人，博士，助理研究员，研究方向：肿瘤发生分子机制。