动物源性食品中65种兽药残留的快速检测方法

王超众， 刘信奎， 张连成， 王萌萌， 董 巍

（1.齐齐哈尔市食品药品检验检测中心，黑龙江 齐齐哈尔161005；2.齐齐哈尔市第一医院，黑龙江 齐齐哈尔161005；3.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161005）

动物源性食品的质量安全问题一直困扰着人们，这其中兽药残留现象比较普遍，后果也较为严重[1，2]。 因此，如何提高检验效率、降低检测成本，控制和消除药残，保证食品安全，是重大民生课题[3-4]。

兽药残留检测存在诸多困难，如残留量甚微、兽药品种繁多、动物源性食品基质复杂等，提取净化方法复杂，检验成本高，耗时耗力等。而且传统的检测方法只针对某一类兽药进行检测，存在筛查范围小、检测效率低等缺点，无法满足大批量检测样品的目的。因此，建立简便、快速、高通量、高灵敏度的方法已成为未来兽药残留检测的趋势。目前同时检测动物源性食品中多种类兽残的国家标准还比较少，主要采用的方法是液相色谱-串联质谱法[5-6]。检索文献有用免疫分析法[7-9]、液相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱联用法[12-13]、超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法[14-17]、超高效液相色谱-串联质谱法[18-24]等。免疫分析法一般只作为初筛或辅助检测手段，出现阳性结果还要进一步质谱确认；液相色谱法应用广泛，但专属性及检测限不高，限制了该方法在兽药残留检测中的应用；气质法灵敏度就高专属性强，但是检测兽药品种范围有限，不适合作为多类兽药残留的检测；液相色谱-串联质谱法灵敏度高，且在定性方面具有较强优势，是如今使用最广泛的兽药残留检测方法。作者应用ProElut PLS-A技术对样品基质进行净化处理，并且建立超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）法对65种兽药残留进行快速检测分析。这些兽药涵盖了磺胺类抗生素、β-受体兴奋剂类、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、糖皮质激素类、雄性激素类、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、抗病毒类、镇静剂类、驱虫剂类、硝基咪唑类、三苯甲烷类、二羟基苯甲酸内酯类、雌激素类、氯霉素类、氯代烃类等18类65种兽药化合物，为动物源性食品中兽药残留筛查提供了一个简单且快速的检测方法，提高了检测效率。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1290 infinity II型超高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品；TSQ.QuantumAccess型三重四级杆质谱仪：美国Thermo Fisher公司产品；XS205DU型电子天平：美国梅特勒公司产品；BSA2202S-CW型电子天平：德国赛多利斯公司产品；Tube Mill型研磨机（配MT40型一次性40mL研磨杯）、MS 3型涡漩混合器：德国IKA公司产品；KQ-1000型超声仪：昆山超声仪器厂产品；Rotina 380R型控温离心机：美国Hettich公司产品；N-EVAP 112型氮吹仪：美国Organomation公司产品；ProElut PLS-A型固相萃取小柱：天津迪马公司产品；Endeavorsil C18，100 mm×2.1mm，1.8μm超高效色谱柱：天津DIKMA公司产品。

65种兽药标准品 （纯度均大于93.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司产品；乙腈、甲醇（色谱纯），德国Merck公司产品；甲酸（优级纯）：天津市光复精细化工研究所产品；水为超纯水；其它试剂为分析纯。

1.2 样品前处理

取畜、禽或水产品的可食部分置研磨机上研磨搅碎，精密称取搅碎的样品2 g，置50 mL离心管中，加入10 mL体积分数0.1%甲酸乙腈，置漩涡混合器上震荡5 min，超声5 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液待净化。小柱不需活化，直接置固相萃取装置上，精密量取离心上清液5 mL加入小柱中，接收流出液，将接收的流出液在40℃条件下氮吹至近干，精密加入1 mL体积分数90%乙腈溶液（含有体积分数0.1%甲酸）1 mL复溶，微孔滤膜过滤，供仪器分析。

1.3 样品检测

1.3.1 色谱条件 进样量 5 μL，柱温 30℃，流量0.2 mL/min。正离子模式采用流动相（单位均为体积分数）A：0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B：体积分数0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2 min，10%A；2～8 min，10%A→60%A；8～10 min，60%A→90%A；10～13 min，90%A；13～14 min，90%A→10%A；14～20 min，10%A。负离子模式采用流动相A：乙腈，流动相 B：10 mmol/L 乙酸铵溶液，梯度洗脱：0～2 min，40%A；2～8 min，40%A→70%A；8～10 min，70%A→90%A；10～13 min，90%A；13～14 min，90%A→40%A；14～20 min，40%A。

1.3.2 质谱条件 电离模式为ESI，正负离子分别扫描，多反应监测模式，电喷雾电压为±4 000 V，离子源温度370℃。目标化合物具体的母离子、定量离子、定性离子、碰撞电压等参数详见表1。

表1 65种兽药残留多反应监测质谱参数Table 1 MRM parameters for the detection of 65 veterinary drugs

续表1

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2 结果与分析

2.1 65种兽药残留的选择

中国目前动物源性食品中兽药残留最大限量的标准法规主要有农业部第193号、第235号、第560号和第2292号公告，以及全国食品安全整顿工作办公室函（整顿办函[2010]50号）等，标准中明确规定了允许使用兽药品种的最高限量以及禁止使用的兽药品种。并且每年国家食品药品监督管理总局都会出台《食品安全监督抽检和风险监测实施细则》（以下简称《细则》），在该《细则》2015 年版之前还未对兽药残留进行控制，之后的2016年版、2017年版和2018年版均已将动物源性食品中的兽药残留的检验列为了重点监控对象，且将风险等级定为了“高”，可见近几年国家对兽药残留的问题已经越来越重视。

作者选择的65种兽药品种都是农业部第193号、第235号、第560号和第2292号公告以及整顿办函[2010]50号等标准中收录的品种，且以上标准对这65种兽药残留限量有着明确规定。本试验所选择的这65种兽药同时也涵盖了 《细则》2016年版、2017年版和2018中规定的除4种硝基呋喃代谢物之外的所有兽药，并且将原本检验需要的51个质量标准综合成为1个标准，大大节省了人力和物力和时间，为食药检系统更好的做好动物源性食品兽药残留的检验提供了有力的技术支持。

2.2 样品提取条件的选择

试验采用不同提取溶剂对目标化合物进行提取，包括体积分数0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇、1%甲酸乙腈3种提取溶剂。结果表明，体积分数0.1%甲酸乙腈与0.1%甲酸甲醇相比，蛋白质沉淀效果更好，提取溶液更澄清，更有利于下一步的净化操作；选择体积分数1%甲酸乙腈作为提取溶解时，会使得部分碱性目标化合物提取效率不好，回收率不高；而选择体积分数0.1%甲酸乙腈作为提取溶剂时，可以满足大多数目标化合物的提取效率，回收率较好，且提取溶剂中乙腈及甲酸挥发性均较强，可减少下一步氮气吹干步骤的时间。试验还曾采用β-葡糖醛酸苷肽酶对样品进行酶解后提取，此步骤可切断药物与基质中氨基的键合，更好的将目标化合物与基质蛋白进行分离，但是酶解过程一般需要超过12 h才能完成，使得分析时间大大延长。试验中加入的微量乙酸亦有使药物与基质蛋白分离的作用，为了满足对大批量样品高通量的分析，故选择了体积分数0.1%甲酸乙腈作为提取溶剂。

2.3 样品净化条件的选择

净化处理是兽药残留检测前处理中至关重要的步骤，因为动物源性食品基质复杂，若净化不完全会造成仪器基线噪音高、干扰目标化合物检测等后果，而且也会加速液质联用仪离子源的污染，进一步影响到仪器灵敏度。本试验应用到的ProElut PLS-A型固相萃取小柱，使用前无需活化，采用固相萃取模式中的保留干扰物模式，采用新型吸附材料PLS-A，基体为高交联的均匀球形聚苯乙烯-二乙烯苯，表面含有极性基团及非极性基团，具有通用性，对非极性、弱极性、强极性化合物具有均衡的保留能力，克服了传统C18、C8等反相吸附材料对极性化合物保留差的缺点。同时材料具有保水性，由于极性基团的存在，即使柱床干涸，材料的保留性质也不会发生变化。另外，由于材料基体为聚合物的特点，可在pH 0～14范围内均表现稳定，而传统的硅胶键合吸附剂pH范围为2～8。此材料还有吸附容量大的特点，传统的硅胶键合材料其基体为多孔硅胶，比表面积为180～450 m2/g范围，新材料的聚合物基体比表面积可达到1 000 m2/g，这样可提供更多的吸附位点，提高净化效率，适合短时间内完成大批量的分析测试。

2.4 流动相的选择

试验比较了乙腈-水，体积分数0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液，甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液等流动相系统，事实证明流动相对目标化合物的色谱分离及质谱灵敏度均有很大的影响。在正离子模式下，在流动相中加入体积分数0.1%的甲酸，可以促进正离子的离子化，提高灵敏度；在负离子模式下，采用乙腈-10 mmol/L乙酸铵溶液系统，可以促进目标化合物分子失去质子带一分子负电荷，灵敏度更高，同时，溶液中有缓冲盐存在时，可以改善化合物的保留时间及色谱峰型，因此最终确立了正离子体积分数0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液以及负离子甲醇-10 mmol/L乙酸铵溶液的流动相系统。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系、检出限和定量限 取不含目标化合物的动物源性食品样品，按照“1.2”项下方法制备空白基质溶液，用空白基质溶液将标准品溶液稀释成质量浓度为 2.0、10.0、20.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL的标准曲线工作液，按照“1.3”项下的方法检测。以质量浓度（X，ng/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果65种兽药的线性关系良好，线性相关系数均大于0.99。并将标准曲线工作进一步稀释，以（S/N）=3 为检出限，（S/N）=10 为定量限，方法检出限为 0.1～1.6 μg/kg，定量限为 0.3～5.3 μg/kg，具体数据见表3。

2.5.2 回收率和精密度 向不含待测物的空白猪肉、牛肉、鸡肉、水产品和奶、蛋样品中进行添加回收率实验，添加质量分数为2、5、10 μg/kg的3个水平标准溶液。65种兽药残留物回收率范围为67.1%～100.2%，相对标准偏差范围为0.1%～7.8%，具体数据见表2。由数据可知，采用本方法检测动物源性食品中的65种兽药残留，具有较好的准确度与精密度。

表2 65种药物检测限、定量限、相关系数、回收率和精密度试验结果Table 2 LOD，LOQ，correlation coefficients，recoveries and precisions of 65 veterinary drugs

续表2

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2.5.3 实际样品检测 按照上述方法检测辖区内抽取的牛肉50份，猪肉50份，鸡肉30份，水产品100份，牛奶30份，鸡蛋30份，结果有2批牛肉检出氯霉素阳性10.2 μg/kg，1批猪肉检出氯丙嗪阳性5.3 μg/kg，1 批鲫鱼检出恩诺沙星阳性 252.3 μg/kg，1批多宝鱼检出地西泮阳性20.0 μg/kg，均超过标准规定最大限度值。

3 结 语

应用ProElut PLS-A技术对样品基质进行净化处理，并且建立超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）法对65种兽药残留进行快速检测分析。多兽药残留品种一步同时提取，提取液直接通过固相萃取柱的净化方式，减少传统方法中对提取液浓缩复溶等复杂的操作，避免样品不必要的损失。同时，前处理操作简单，一步净化的方法克服了传统方法中SPE需要进行活化平衡等繁琐的步骤，节约时间、节省溶剂，减少人员操作成本，且无需特殊实验装置，检测兽药种类较多。

作者建立了UHPLC-MS/MS分析方法，该方法灵敏度高、专属性强、结果准确，在样品基质复杂，目标化合物理化性质差异较大的条件下实现了同时测定，为大批量动物源性食品中兽药多残留检测提供简便可靠的方法。