烤烟不同部位叶片超微结构与常规化学成分的关系

夏春，李寒雪，孙觅，曹明锋，刘园，刘欢，雷晓，何佶弦，景延秋，程玉渊，杨益芬6

(1.中国烟草总公司四川省公司，四川 成都 610000；2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450002；3.湖南省烟草公司常德市公司，湖南 常德 415000；4.河南省烟草公司南阳市公司，河南 南阳 473000；5.河南农业大学烟草学院，河南 郑州450002；6.成都海关技术中心，四川 成都 610041)

朱尊权[1]、于华堂等[2]的研究表明，烟叶成熟度、叶片结构与细胞形态特征具有密切关系，细胞的大小和排列方式决定了叶片结构的疏密程度，不同成熟度烟叶的叶片结构疏密程度不同。时向东等[3]研究了烤烟叶片生长发育过程中细胞超微结构变化，结果表明，随着叶长的增加，栅栏细胞的体积逐渐增大，叶绿体结构逐渐完善，淀粉粒和嗜锇颗粒体积逐渐增大，烟叶适熟采收时，叶绿体数量减少，淀粉粒和嗜锇颗粒充实细胞内部，烟叶产量和质量达到最佳；而嗜锇物质与淀粉粒不仅与烤烟香气质量具有一定联系[4]，还可能与烟叶叶绿体代谢、烟叶风格的形成有关。滑夏华等[5]对比分析了河南与云南烤烟生长发育过程中叶片超微结构的差异，认为两地烟叶在生长发育过程中叶片超微结构的变化规律相似；生育前期叶绿体内淀粉粒和嗜锇颗粒较少；生育中期表现为淀粉粒较多、嗜锇颗粒较少；生育后期叶绿体降解速度较慢，嗜锇颗粒较少。云南烟叶生育期较长，叶绿体代谢较活跃，这可能是云南烟叶风格为清香型的形成原因之一。过伟民等[6–8]通过对烤后烟叶进行扫描电镜观察，已初步建立细胞形态特征指标的量化方法，探讨不同产地、不同部位间烟叶表面微观形态特征的相似性和差异性，并试图建立烤烟叶片微观结构与物理、外观品质间的关系模型。笔者对不同部位烤烟叶片超微结构进行量化处理，探讨烤烟不同部位间叶片超微结构的差异，采用典型相关分析方法，分析超微结构指标与烤烟常规化学成分含量的关系，旨在明确与烤烟品质指标相关的细胞指标，为从微观角度改善烤烟化学品质提供新的研究途径。

1 材料与方法

1.1 材料

以河南登封市大金店、石道、颖阳和君召镇 4个植烟区种植的豫烟6号品种为材料，于适熟期取下部(叶位 5～7)、中部(叶位 8～12)和上部(13～18)鲜烟叶用于透射电子显微镜观察；采摘后统一标记编杆入烤房烘烤。

1.2 方法

1.2.1 烟叶超微结构观察及指标的量化

在烤烟叶片主脉中部附近切取2 mm×2 mm材料，参照文献[5]的方法进行固定，于透射电子显微镜(JEM–1400日本)下观察全细胞、细胞核、叶绿体、线粒体等结构并拍照。采用 Adobe Photoshop CC 2015软件，基于像素比值法[9–12]，对每个图像中细胞面积(X1)、细胞周长(X2)、细胞因子(X3)、液泡面积(X4)、液泡面积与细胞面积比值(X5)、细胞壁厚度(X6)等指标进行量化。

1.2.2 烤烟化学常规成分含量的测定

剔除有明显病斑或因烘烤因素造成糟片、挂灰的烤烟，送交河南省郑州市黄金叶技术指导中心，按叶位测定烟叶常规化学成分蛋白质(Y1)、钾(Y2)、氯(Y3)、还原糖(Y4)、总糖(Y5)、烟碱(Y6)、总氮(Y7)含量。

1.3 数据处理

采用SPSS l8.0软件对数据进行方差分析、简单相关分析和典型相关分析。

2 结果与分析

2.1 烤烟不同叶位叶片超微结构的差异

观察烤烟叶片超微结构，中、下部叶细胞与上部叶对比略偏椭圆，排列与上部叶相似(图1–1、2、3)；叶片表面细胞轮廓清晰(图1–4、5、6)，细胞壁内部均明显有细胞核、叶绿体、线粒体等贴壁分布，中央液泡填充细胞中部(图1–4、5、6)；上部叶细胞呈圆形且排列紧密、整齐(图1–1、4、7)；叶肉细胞细胞核染色质凝聚随叶位升高而有所加剧(图1–7、8、9)，叶绿体外膜和类囊体片层均出现降解现象，叶绿体外观模糊，类囊体结构松散，叶绿体周围均有少数线粒体分布，且其内部均含有清晰的淀粉粒和嗜锇颗粒(图1–10、11、12)，叶肉细胞内器官状态随着叶位升高而更好，淀粉粒和嗜锇颗粒含量也随着叶位升高而升高。叶肉细胞电镜图像量化结果表明，液泡面积与细胞面积的比值从大到小依次为下部叶、中部叶、上部叶，说明随着叶位的上升，叶肉细胞细胞器、淀粉粒、嗜锇颗粒等物质越丰富。

图1 烤烟不同叶位叶片的超微结构Fig.1 Ultrastructural morphology of leaves in different leaf positions of flue-cured tobacco

采用最小显著差异法，对不同叶位烤烟叶片细胞超微结构量化指标进行方差分析和多重比较，结果(表1)表明，上部叶细胞面积最大，下部叶周长最大，中部叶细胞面积、周长最小，且上部叶细胞面积极显著大于中部叶，细胞周长极显著大于中部叶；细胞因子变化很小，且均接近 1，形状相对规则；下部叶液泡面积最大，中部叶液泡面积最小，且下部叶液泡面积极显著大于中部叶；下部叶液泡面积与细胞面积的比值最大，上部叶最小，且下部叶极显著大于上部叶；下部叶细胞壁厚度最大，中部叶细胞壁厚度最小，且下部叶细胞壁厚度极显著大于上、中部叶。

表1 烤烟不同部位叶片超微结构指标的量化结果Table 1 Quantitative results of ultrastructural indexes of flue-cured tobacco leaves in different parts

2.2 不同部位烟叶的常规化学成分的差异

不同部位烟叶的常规化学成分含量及多重比较结果如表2所示。下部叶蛋白质、钾、氯含量极显著高于中部叶和上部叶，中部叶与上部叶的差异无统计学意义；上部叶烟碱、总氮含量极显著高于中部叶和上部叶，中部叶与上部叶的差异无统计学意义；中部叶还原糖含量极显著高于下部叶和上部叶，下部叶和上部叶的差异无统计学意义；上部叶与中部叶总糖含量极显著大于下部叶，上部叶与中部叶之间的差异无统计学意义。综上，上部叶烟碱和总氮含量较高，钾含量较低；中部叶还原糖和总糖含量较高，蛋白质、氯、总氮含量较低；下部叶蛋白质、钾和氯含量较高，还原糖、总糖和烟碱含量最低。

表2 不同部位烟叶的常规化学成分含量Table 2 Conventional chemical composition indexes in different parts of flue-cured tobacco %

2.3 描述性统计分析

对细胞结构量化结果和烤烟常规化学成分指标进行描述性统计分析，结果(表3)表明，细胞指标变异系数大小依次是细胞因子、细胞壁厚度、液泡面积和细胞面积、细胞周长、液泡面积/细胞面积；烤烟常规化学成分指标变异系数大小依次是氯、钾、烟碱、总氮、蛋白质、还原糖、总糖。除烤烟指标总糖偏度系数小于 0，为左偏峰外，细胞指标以及其余烤烟指标均大于 0，为右偏峰，其细胞指标中细胞因子和细胞壁厚度与烤烟指标中钾和氯的偏度系数较大，正向偏态较明显；细胞指标中，细胞面积、细胞周长与液泡面积/细胞面积的峰度系数小于 0，为平阔峰，数据较为分散，剩余指标峰度系数大于 0，为削尖峰，数据较为集中。综上，细胞指标和烤烟各指标均呈正态分布，表明数据稳定性较好，具有较好的统计学意义。

表3 烟叶细胞微观结构量化结果与常规化学成分描述性统计Table 3 Quantitative results of cell microstructure and descriptive statistical analysis of conventional chemical components

2.4 烤烟叶片超微结构指标与常规化学成分的典型相关分析

将烤烟叶片细胞量化指标细胞面积、细胞周长、细胞因子、液泡面积、液泡面积/细胞面积、细胞壁厚度作为第1组变量，烤烟常规化学成分指标蛋白质、钾、氯、还原糖、总糖、烟碱与总氮作为第2组变量进行典型相关分析，结果列于表4。典型变量Ⅰ和典型变量Ⅱ均达到极显著相关水平，相关系数λ分别为0.692和0.630；典型变量Ⅲ和典型变量Ⅳ均达到了显著相关水平，相关系数λ分别为0.379和0.320，后2组的典型相关系数则不显著，因此选择典型变量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行分析。

表4 烟叶细胞微观结构量化结果与常规化学成分指标的典型相关Table 4 Typical correlation analysis between quantitative results of cell microstructure and conventional chemical composition indexes

典型变量Ⅰ分析结果表明，细胞壁厚度与蛋白质和氯存在较高的负相关，说明随着细胞壁厚度的增加，烤烟中蛋白质和氯含量呈增加趋势，总糖呈降低趋势。典型变量Ⅱ分析结果表明，细胞面积、细胞周长、细胞因子、烟碱与总氮存在较高正相关，说明随着细胞面积、细胞周长、细胞因子的增大，烤烟中烟碱和总氮含量呈增加趋势。典型变量Ⅲ分析结果表明，细胞面积和液泡面积与还原糖含量存在较高的负相关，说明随着细胞面积、液泡面积的增大，烤烟中还原糖含量呈降低趋势。典型变量Ⅳ分析结果表明，细胞因子和液泡面积/细胞面积与蛋白质含量存在较高的负相关，说明随着细胞因子、液泡面积与细胞面积的比值升高，烤烟中蛋白质含量呈降低趋势。典型变量Ⅴ、Ⅵ相关系数与显著性水平普遍较低，因此可以认为细胞指标与烤烟常规化学成分指标间没有明显相关性。

3 结论与讨论

运用Adobe Photoshop CC 2015软件，采用像素比值法对烤烟不同叶位间叶片超微结构进行指标量化。细胞壁决定细胞形状，其主要成分是果胶和纤维素[13–14]，因而影响烤烟的形态结构。烘烤过程中细胞壁物质降解并转化为低糖和单糖物质，烟叶组织结构和细胞骨架结构被破坏，表现为烤烟叶片形态收缩扭曲[15–16]。本试验结果表明，烤烟不同叶位间细胞壁厚度差异显著，细胞壁厚度与蛋白质和氯含量呈较高正相关，与总糖含量呈负相关。细胞壁越厚，其细胞壁物质含量越高，但对烤烟香气质和香气量越不利，使烤烟杂气增加[17–18]。细胞壁越厚，烤烟的蛋白质、氯含量越高，会使烟叶燃烧性不良，吃味差，刺激性大，品质下降。

上部叶细胞面积极显著大于中部叶，身份适中与身份较薄的烤烟对比，前者细胞面积较后者大[7]，所以烤烟上部叶身份普遍较中部叶厚；下部叶和上部叶的细胞周长显著大于中部叶，细胞周长与叶片厚度呈极显著负相关[8]，所以下部叶和上部叶厚度小于中部叶，这与叶片厚度随着叶位的升高而增加有出入，可能是由于烤烟叶片厚度还和细胞排列方式有关[8]所致。细胞指标与烤烟常规化学成分指标典型相关分析结果表明，细胞面积、周长与烤烟烟碱和总氮含量呈正相关。细胞面积和周长的值越大，其身份越厚；厚度越大，烟碱、总氮与蛋白质含量随着烤烟叶片厚度变大、身份增厚而变大[19]；细胞因子越大，细胞偏离圆形程度越大，烤烟叶片厚度越小，身份越薄[8]。根据这些分析推断，蛋白质、烟碱、总氮含量越高，细胞形状因子应该越小。本试验结果表明，细胞形状因子与蛋白质含量呈负相关关系，这与上述结果一致；细胞形状因子与总氮和烟碱含量呈正相关，这可能是因为烤烟总氮和烟碱含量不仅与烤烟细胞排列和烤烟叶片物理性状有关系，还与其细胞中其他内含物有关[20]。

从烤烟叶片超微结构图像中可以看出，单个细胞内叶绿体、线粒体、淀粉粒与嗜锇物质贴壁排布，细胞中间由中央大液泡填充。烟叶品质成分中大部分或者全部糖类物质在叶绿体中合成后，一部分储存于叶绿体中，另一部分储存于液泡当中[21]。本研究结果表明，细胞中液泡面积越大，叶绿体等细胞器含量越少，烟叶品质成分中糖类物质合成越少，因而液泡面积与细胞面积的比值与烤烟还原糖含量呈负相关。此外，随着液泡面积与细胞面积比值的增加，烤烟蛋白质含量降低，可能是因为液泡面积占细胞面积比值越大，细胞中叶绿体、淀粉粒和嗜锇物质含量越少，淀粉粒和嗜锇物质积累量不足，造成烟叶调制过程中生理生化反应不充分，加大了调制难度所致。在分析烤烟叶片叶绿体、淀粉粒、嗜锇物质和液泡各自面积大小对烤烟常规化学成分影响情况时，需考虑细胞面积指标，需进一步加大研究建立细胞器面积与细胞面积的比值与烤烟品质指标间的数学模型。