香梨优斑螟脂肪酸Δ9去饱和酶基因序列及不同虫态的表达分析

王德钢,马光皇,贺鹏鹏,熊仁次,曹 玉,张 萍,韩 旭,杨明禄,3

(1.塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.塔里木大学南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆阿拉尔，843300；3.农业部阿拉尔作物有害生物科学观测站，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】香梨优斑螟(Euzopherapyriella)属鳞翅目螟蛾科斑螟亚科优斑螟属[1]，为新疆香梨产区特有的果树蛀干害虫。该虫广泛分布在新疆乌鲁木齐、塔城、博乐、伊宁、昌吉、哈密、吐鲁番、库尔勒和阿克苏等地，主要寄主有梨、苹果、无花果、枣、杏、巴旦杏、桃和杨树等。部分产区被害率高达50%，为害严重的，造成树体的大量死亡[2]，在阿克苏地区5年以上香梨盛果园内香梨优斑螟危害率达100%，造成严重的经济损失[2]。脂肪中不饱和脂肪酸的比例影响着生物体细胞膜的流动性，在低温状态下这种流动性显得尤为重要，合成不饱和脂肪酸的关键酶之一脂肪酸去饱和酶成为研究生物耐寒机制中的热点。另一方面，脂肪酸去饱和酶在昆虫性信息素合成中也起到非常重要的作用[3]。研究脂肪酸去饱和酶对昆虫繁育和生活习性方面有重要作用，对有害昆虫的成灾机制研究有重要意义。【前人研究进展】脂肪酸去饱和酶根据作用底物及结合载体、存在的状态和引入双键的位置等差异有3种分类方式：(1)根据酶作用的底物以及结合载体的不同，可以分为酰基辅酶A去饱和酶(acyl-CoA FAD)，主要存在于动物及真菌的内质网膜上，作用底物是与CoA结合的脂肪酸；酰基-ACP去饱和酶(acyl-ACP FAD)，存在于植物的叶绿体或质体的基质中，作用底物是与ACP结合的脂肪酸，也是脂肪酸去饱和酶家族唯一可溶性酶；酰基脂肪去饱和酶(acyl-lipid FAD)，主要存在于高等植物和蓝藻中，作用底物是以结合脂形式存在的脂肪酸[4]。(2)依据脂肪酸去饱和酶的存在状态，可分为可溶性蛋白和膜结合蛋白，除了植物的acyl-ACP FAD是唯一可知的可溶性去饱和酶，其余的都是膜结合的FAD[5-6]。(3)根据去饱和过程中引入双键的位置脂肪酸去饱和酶又可分为“前端”去饱和酶和“甲基端”去饱和酶两类[7-8]。FAD9在真核细胞中是普遍存在的，对调控膜的流动性起着重要作用，其在脂肪酸去饱和酶家族中相对其他基因研究倍受关注。2002年从家蝇(Muscadomestica)体内克隆出FAD9去饱和酶基因[9]，后续从斜纹夜蛾(Ctenopseustisobliquana)等昆虫的体内克隆了FAD9去饱和酶基因[10]，之后在脂肪酸去饱和酶的研究中在毛眼林蚁(Formicaexsecta)转录组中发现了FAD9基因，并认为该基因对蚂蚁不同个体之间的相互交流存在非常重要的作用[11]，家蚕转录组中也鉴定得到很多脂肪酸去饱和酶基因家族的成员，其中包含FAD9基因[12]。不饱和脂肪酸作为耐寒物质早就被人们所关注，但关于FADs基因与昆虫耐寒性方面的研究，起步明显较晚，直到2007年，在葱蝇(Deliaantique)中首次被证实了脂肪酸去饱和酶Δ9基因与耐寒性的关系，当温度降低时，在冷驯化和滞育蛹的脑、中肠和马尔皮吉亚小管中，mRNA中的Δ9基因表达上调了2～10倍，这与增强耐寒性存在很明显的相关性[13]，这也表明了昆虫的耐寒性与FAD9的紧密关系，当受到外界低温刺激时，昆虫FAD9基因表达上升以此增强自身抗寒能力，由此逐渐开始了从FADs家族研究昆虫抗寒能力。目前，已有许多在昆虫耐寒性方面的研究表明其耐寒性与脂肪酸△9去饱和酶基因存在联系。对红尾肉蝇滞育相关基因进行分析时，同样发现了脂肪酸△9去饱和酶基因表达量呈上升趋势[14]；利用qPCR技术对滞育时期白纹伊蚊进行分析，发现在低温下滞育6 d后的FAD9基因是未滞育的FAD9基因表达量的1.8倍[15]；在对弹尾目跳虫耐寒性的研究中发现，5℃下48 h后，FAD9基因表达量上升了5倍，这些均表明了昆虫通过增加FAD9基因表达量来提高不饱和脂肪酸含量，进而提升其耐寒性[16]。【本研究切入点】研究该基因序列隆鉴定后进行生物信息学。【拟解决的关键问题】对该基因在3种不同虫态下的表达量进行研究，分析香梨优斑螟在变态发育过程中的不同阶段该基因的表达。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 虫源

采集阿拉尔市塔里木大学校园内梨园香梨优斑螟老熟幼虫，实验室内待其化蛹、羽化，所得幼虫、蛹和成虫，分别用液氮处理后-80℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

总RNA提取为TRIzon总RNA提取试剂，反转录试剂盒为 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix，用于PCR扩增的Taq酶均购自康为世纪公司；用于PCR扩增的dNTP Mixture (10 mM)，荧光定量试剂SGExcel UltraSYBR Master 预混液均购自上海生工生物(工程)有限公司；克隆试剂盒pMDTM19-T Vector Cloning Kit购自宝日医生物技术(北京)有限公司；克隆感受态细胞Trans5α Chemically Competent Cell和琼脂糖凝胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit购自北京全式金生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 香梨优斑螟FAD9基因扩增、克隆

1.2.1.1 总RNA提取与cDNA合成

采用TRIzon总RNA提取试剂提取RNA，并用核酸检测仪(NanoDrop 2000，Thermo公司)检测RNA样品质量浓度。按照 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix 试剂盒步骤去除总RNA中少量基因组DNA，并以1.0 μg总RNA为模板合成cDNA，稀释10倍后-20℃保存。

1.2.1.2EpFAD9简并引物设计、扩增与克隆

在NCBI数据库搜索FAD9基因编码蛋白序列，选取甘蓝夜蛾ABX90048.1、小地老虎AGR49311.1、美洲棉铃虫(Helicoverpazea)AAF81790.2、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)AAL27034.1、红带卷蛾(Argyrotaenia velutinana)AAF44709.1、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)AAB92583.1、苹淡褐卷蛾AAL35750.1氨基酸序列，然后提交到CODEHOP 服务器设计简并引物，挑选出3对引物由上海生工合成。扩增程序为：预变性 94℃ 3 min ；变性 95℃ 30 s，复性 54℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共34个循环；终延伸10 min。利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR产物，连接至 pMD19-T Vector 载体，转化感受态大肠杆菌细胞，培养12～16 h后挑取单克隆菌进行菌液PCR验证，选取理想目标菌液，送上海生工测序测序。

1.2.2 荧光定量

1.2.2.1 总RNA提取与cDNA合成

幼虫、蛹和成虫每个虫态各3只，提取方法与cDNA合成同3.3.1。

1.2.2.2EpFAD9荧光定量引物设计与qPCR

利用Primer Premier 5.0软件，根据EpFAD9已知序列设计特异引物，以香梨优斑螟18 s内参基因为对照基因[17]，引物由上海生工合成，qPCR反应采用荧光染料 SYBR GreenⅠ，根据SGExcel UltraSYBR Master试剂盒说明书要求，使用10 μL体系，在Mastercycler ep realplex中进行扩增，PCR程序采用3步法，条件为：95℃ 3 min(预变性)，95℃ 15 s(变性)，56℃ 20 s(退火)，72℃ 25 s(延伸)， 40个循环；熔解曲线：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 EpFAD9基因定量引物Table 1 Real-time PCR primers of EpFAD9 Gene

1.3 数据处理

利用NCBI的ORF Finder工具推测序列的蛋白质氨基酸序列；BLAST搜索同源性序列，用MEGA软件分析蛋白质氨基酸序列，构建系统进化树；并用Protparam软件(https://web.expasy.org/ protparam/)对蛋白进行理化性质分析；利用SignalP 4.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析该蛋白信号肽；TMHMM Server v2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析预测的蛋白跨膜结构；用ProtScale软件(https://web.expasy.org/protscale/)预测该蛋白亲疏水性；用SOPMA软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_sopma.html)分析蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL(https://www.swissmo-del.expasy.org/)中的自动方式(automated mode)进行同源建模，预测蛋白的三维结构；用NetPhos 3.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)分析EpFAD9蛋白潜在磷酸化位点；用PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/ form2.html)工具预测该蛋白产物的亚细胞定位；EpFAD9基因在不同虫态的相对表达分析采用相对定量法(2-△△CT法)计算[18]。

2 结果与分析

2.1 EpFAD9基因克隆

总RNA提取结果经检测OD260/280与OD260/230比值均在1.9～2.0，简并引物使用普通PCR扩增方法筛选后合适引物为EpFAD9F：5'-CGACCCTATCCTGAGATTCCAGAARAARTAYTA-3'，EpFAD9R：5'-GCCTTCTCCGAGCGRAARAARTA-3'，利用该简并引物扩增的产物克隆测序后得到一段长为268 bp的核酸序列，通过对该实验室香梨优斑螟转录组测序数据库的比对，发现1条3 822 bp的此基因序列，并包含了完整开放阅读框，分析了基因的蛋白特性等信息。

2.2 EpFAD9基因生物信息学

2.2.1 蛋白特性

该基因的开放阅读框长度为1 056 bp，编码352个氨基酸，起始密码子位于序列第1 280碱基ATG，终止密码子位于序列第2 338碱基TAA。图1

注：灰色表示FAD9的起始密码子ATG和终止密码子TAA
Note:Grey indicates the initiation codoni ATG and termination codon TAA ofFAD9

图1 香梨优斑螟FAD9基因序列和推导的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences ofEuzopherapyriellaFAD9

对EpFAD9推测氨基酸序列的分子式为C1895H2800N496O496S7，原子总数5 694，相对分子量为40 690.52 u；理论等电点是9.09，呈碱性；带负电残基(Asp + Glu)总数为32，带正电残基(Arg + Lys)总数为38。

该蛋白共由20种氨基酸组成，丙氨酸(Ala)最多，有35个占总数的9.9%，其次为亮氨酸(Leu)，有31个，占总数的8.8%，含量最少的是半胱氨酸(Cys)，只有1个，占总数的0.3%，没有吡咯赖氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。表2

2.2.2EpFAD9系统发育树的构建及同源性

将EpFAD9氨基酸序列在NCBI中进行Blastp分析，结果显示与烟草天蛾(Manducasexta)相似度达到89%，与苹淡褐卷蛾(Epiphyaspostvittana)、马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)等其它16个昆虫物种FAD9相似度都达到了80%以上。

将17个物种FAD9编码的氨基酸序列利用Mega 7.2的邻接法NJ(bootstrap检验，1 000次重复)聚类分析、构建系统进化树，香梨优斑螟与烟草天蛾在一分支上，说明其亲缘关系最近，与欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、柞蚕(Antheraeapernyi)等4种昆虫亲缘关系较近，与大头金蝇(Chrysomyamegacephala)、蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneurarosaceana)、平行卷叶蛾(Choristoneuraparallela)和苹淡褐卷蛾、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)等几种夜蛾、卷蛾科的昆虫关系较远。图2

2.2.3EpFAD9蛋白信号肽

EpFAD9蛋白信号肽分析，发现该蛋白最大C分值为0.117、最大Y分值为0.114以及最大S分值为0.131，均小于阈值(0.500)，因此，认为EpFAD9无明显的信号肽。图3

图2 香梨优斑螟及其他昆虫FAD9氨基酸序列构建的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree construction ofFAD9 amino acid sequence ofEuzopherapyriellaand other insects

图3EpFAD9基因编码蛋白信号肽预测
Fig.3 Amino acid composition ofEpFAD9 gene signal peptide prediction

2.2.4EpFAD9蛋白跨膜结构

研究表明,EpFAD9蛋白有4个跨膜螺旋，其位置分别位于第39-61、71-93、186-208和213-235氨基酸序列。图4

2.2.5EpFAD9蛋白亲疏水

研究表明,香梨优斑螟FAD9蛋白中亲水性最强的是第34位的天冬酰胺(Asn)和第128位的甲硫氨酸(Met)，疏水性最强的是第48位的丙氨酸(Ala)和第193位的亮氨酸(Leu)，亲水性氨基酸总数多于疏水性氨基酸，并且亲水性最大值明显大于疏水性最大值，该蛋白整体为偏向亲水性。图5

2.2.6EpFAD9蛋白结构预测

香梨优斑螟FAD9蛋白二级结构中α-螺旋130个氨基酸所占比例为36.93%，延伸链59个氨基酸占比例为16.76%，无规卷曲147个氨基酸占41.76%，β-转角16个氨基酸所占比例为4.55%。图6

在预测的香梨优斑螟FAD9蛋白的三维结构建模中，螺旋结构和不规则卷曲结构比例很大，少量延伸链状结构，这也与二级结构的预测结果相吻合。图7

图4EpFAD9基因编码蛋白跨膜结构
Fig.4 Amino acid composition ofEpFAD9 gene transmembrane structure analysis

2.2.7EpFAD9蛋白磷酸化位点

在预测的EpFAD9蛋白中，含有15个丝氨酸(Ser)、21个苏氨酸 (Thr)、 19个酪氨酸(Tyr)，其中潜在磷酸化位点有7个丝氨酸、7个苏氨酸和4个酪氨酸。图8

图5EpFAD9基因编码蛋白亲疏水性
Fig.5 Amino acid composition ofEpFAD9 gene hydrophilic-hydrophobic analysis

注：A.二级结构分析 B.峰值变化
Note:A.secondary structure analysis B.Peak change

图6EpFAD9基因编码蛋白二级结构
Fig.6 Amino acid composition ofEpFAD9 gene secondary structure analysis

图7EpFAD9基因编码蛋白三级结构预测
Fig.7 Amino acid composition ofEpFAD9 gene Tertiary structure prediction

2.2.8EpFAD9蛋白亚细胞定位

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。亚细胞定位的预测一般通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的亚细胞定位的相似度，然后以一组概率值的形式作出判断。

预测EpFAD9编码产物的亚细胞定位，其分布在内质网的可能性为44.4%，分布在线粒体中的可能性为22.2%，分布在高尔基体的可能性同样是22.2%。表3

图8EpFAD9基因编码蛋白磷酸化位点
Fig.8 Amino acid composition ofEpFAD9 gene phosphorylation site analysis

表3 EpFAD9基因编码蛋白亚细胞定位Table 3 Amino acid composition of EpFAD9 gene Subcellular localization analysis

2.3 EpFAD9基因表达

利用 qPCR 检测香梨优斑螟不同虫态的表达水平，结果显示，在香梨优斑螟的成虫和蛹期表达量差异很小，都维持在一个相对较低的水平，但是，该基因在幼虫期高水平表达，极显著高于成虫期和蛹期，相对表达量分别是成虫期的17.75倍，蛹期的29.59倍。图9

图9EpFAD9基因在不同虫态中的基因相对表达量
Fig.9 Relative expression ofEpFAD9 gene in different insect States

3 讨 论

香梨优斑螟以幼虫越冬，在越冬期间不饱和脂肪酸相对含量均高于越冬前后期，饱和脂肪酸则与之相反，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的相对含量和比例的变化对香梨优斑螟滞育幼虫越冬起到关键作用[19]。而FAD9基因是不饱和脂肪酸合成通路中的首个去饱和酶，它对油酸(C18∶1)及亚油酸(C18∶2)等不饱和脂肪酸合成有重要作用，这2种不和脂肪酸在昆虫体内占有较大比例，对生物膜流动性有重要作用[20]。昆虫FAD为膜结合蛋白，序列在两端保守性低，也是许多生物活性分子如性信息素的前体物质，对多细胞有机体的细胞生物学功能起着重要的维系和调节作用[21]。

EpFAD9基因开放阅读框长1 056 bp，编码352个氨基酸，其长度与斜纹夜蛾、海胆卷蛾(Ctenopseustisherana)[22]和小地老虎(Agrotisipsilon)[23]等昆虫FAD9基因蛋白编码长度一致，氨基酸组成中丙氨酸最多，有35个占总数的9.9%，不含有吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸，在对弓形虫FAD9基因的研究结果同样显示为丙氨酸的含量最高[24]。氨基酸组成与与蛋白折叠息息相关，决定了蛋白质亲疏水性，EpFAD9编码蛋白质为亲水性蛋白，推测其包含4个跨膜结构域，与多数真核生物脂肪酸△9去饱和酶基因相同[25-27]，跨膜结构是由跨膜蛋白的效应区域所展现，包括细胞能量交换及物质转运等多种生物膜功能。磷酸化位点是蛋白翻译后的重要修饰位点，与信息的识别与传递有关，对调节蛋白的功能发挥着重要作用[28]。在对EpFAD9编码蛋白的预测中显示有多个磷酸化位点，从而更有利于该蛋白质与机体内其他分子或蛋白相互作用，也表明EpFAD9蛋白质酶活力较强。对EpFAD9蛋白进行亚细胞定位预测发现,其可能在内质网、线粒体、高尔基体发挥其生物学作用，主要存在于内质网上，这一预测结果与在小鼠中研究结论相同[26]。

脂肪酸去饱和酶基因作为合成通路中的关键基因，其表达水平高低直接影响昆虫体内不饱和脂肪酸积累，香梨优斑螟幼虫状态下EpFAD9含量远远高于蛹和成虫，说明香梨优斑螟幼虫时期不饱和脂肪酸的代谢速度远高于成虫期和蛹期，可能为变态发育过程准备充足的营养物质[29]。由此推测香梨优斑螟幼虫抵抗低温能力更强，这与香梨优斑螟以幼虫越冬相吻合[30]。蛹和成虫的FAD9基因表达量相对较低，可能这2种虫态多以脂肪消耗代谢为主有关。

4 结 论

EpFAD9基因基因在香梨优斑螟不同虫态下存在表达差异，在幼虫体内的表达量最高，成虫和蛹期的表达很低，尤其是虫蛹，其表达量更低于成虫，虫蛹和成虫状态下的香梨优斑螟对低温抵抗能力都低于幼虫。