丹酚酸B对小鼠体内抗氧化和肠道微生物群落的影响

赵孟浩，冯祎浓，尹玉文，李承前，孙国杰,*

（1.河北科技大学生命科学与工程学院，河北 石家庄 050018;2.河北禾盛源生态农业科技开发有限公司，河北 唐山 063000）

生物体在新陈代谢过程中会不断产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），过量ROS会对DNA、脂质、蛋白质等生物分子产生损伤。炎症出现的一个重要因素就是ROS的增加[1]。研究表明，炎症可使主动脉脂质异常积聚，形成粥样斑块，导致心脑血管疾病的发生[2]。内源性抗氧化物质不足以完全防止损伤，因此从外部补充抗氧化剂对于维持机体健康至关重要[3]。丹酚酸B作为丹参水溶性成分中含量最高的功能性物质[4]，体外抗氧化实验证明丹酚酸B有抗氧化和清除自由基的能力。大量细胞实验[5-7]也表明，丹酚酸B作为丹参中活性最强的水溶性物质有很强的抗氧化能力[8]。

肠道作为药物消化吸收的主要场所，在药物代谢过程中发挥着重要的作用。对编码基因比人类基因组还要多100 倍的肠道微生物来说，不仅在营养物质的消化过程[9]中扮演着重要的角色，在代谢[10]和免疫[11-12]中依然起着重要的作用。大量的研究表明，肠道微生物群落的失调和异常会导致糖尿病[13]、心血管疾病[14]、肝病[15]和肥胖症[16]等多种疾病。丹酚酸B和肠道微生物都被证实和心血管疾病相关，而对于丹酚酸B和肠道微生物之间关系的研究较少。丹酚酸B属于多酚物质，多酚物质在肠道中主要的调节方式有2 种：一种是为微生物提供代谢底物，促进有益菌的繁殖;另一种是利用抗菌活性抑制有害菌的繁殖。基于以上发现，本实验进行了针对丹酚酸B的体内抗氧化实验和肠道微生物群落分析，研究丹酚酸B对肠道微生物的影响，为治疗心血管疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

健康SPF级昆明小鼠，体质量（20±2）g，购自河北医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（冀）2013-1003。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究所;Stool Genomic DNA kit粪便基因组DNA提取试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司;蛋白浓度测定试剂盒 北京Solarbio科技有限公司;丹酚酸B为自制品（含量83.8%）;其他溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UPR-11-10T超纯水器 四川优普超纯科技有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;TGL-16G离心机 上海安亭科学仪器厂;SpectraMax i3酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司;DYY-6C稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂;Ketagalan GL凝胶成像分析系统 美国威泰克公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及给药

将30 只SPF级昆明小鼠于日光灯照明下，12 h昼夜交替，温度（25±1）℃，适应性饲养1 周后开始实验。小鼠分成5 组：正常组（NC组，灌胃生理盐水）、丹酚酸B低剂量组（L组，灌胃30 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B中剂量组（M组，灌胃60 mg/kgmb丹酚酸B）、丹酚酸B高剂量组（H组，灌胃120 mg/kgmb丹酚酸B）、VC阳性对照组（PC组，灌胃100 mg/kgmbVC）。每组6 只，标记后称量并记录初始体质量，每日上午9∶00通过灌胃给药，给药42 d。

1.3.2 样品采集

末次给药24 h后，将所有小鼠分隔开，收集粪便。每组选取4 只小鼠粪便进行基因组的提取。通过眼球采血方式收集血液，3 500 r/min离心10 min取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。断头脱臼处死小鼠，取小鼠心、肝、肾、脾组织，称质量用于计算脏器指数。将肝脏组织用质量分数0.9%的生理盐水制备成质量分数10%的肝匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 小鼠粪便基因组提取和处理

从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列为：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）;806R（5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，HiSeq2500 PE250上机测序[17]。

1.3.4 指标检测

小鼠体质量的变化量按照式（1）计算。

式中：m1为灌胃不同时间后的体质量/g;m2为最初体质量/g。

小鼠脏器指数按式（2）计算。

按照试剂盒说明检测MDA的含量和SOD、GSH的活力。

1.4 数据统计分析

肠道微生物群落利用LEfSe软件对差异组间进行分析，先对所有组样品间进行Kruskal-Wallis秩和检验（一种多样本比较时常用的检验方法），将筛选出的差异再通过wilcoxon秩和检验（一种两样本成组比较常用的检验方法）进行两两组间比较，最后筛选出的差异使用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）展示[18]。默认展示P＜0.05、LDA＞2的菌群。实验数据使用SPSS 22.0统计软件分析实验数据，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异。若方差齐，差异采用LSD法进行多重比较，若方差不齐则采用Games-Howell比较。测定结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 小鼠粪便细菌基因组的提取

图 1 小鼠粪便细菌基因组电泳图Fig. 1 Electropherogram of mouse fecal bacterial genome

图 2 PCR产物电泳图Fig. 2 Electropherogram of polymerase chain reaction amplified products

每组选取4 只小鼠粪便进行粪便基因组的提取，提取后电泳图如图1所示。从每组4 个基因组中选取3 个进行PCR扩增，扩增条带大小465 bp，扩增后电泳图如图2所示。扩增后产物条带位置正确，条带清晰，无杂带，可以用于后续实验。

2.2 小鼠体质量的变化

表 1 小鼠体质量的变化（n＝ 6）Table 1 Changes in body mass of mice (n= 6)g

由表1可知，小鼠在灌胃丹酚酸B 6 周之后，各实验处理组相对于正常组体质量变化没有显著差异。

2.3 小鼠脏器指数

表 2 小鼠脏器指数（n＝ 6）Table 2 Mouse organ coefficients (n= 6)

脏器指数增大表明脏器充血、水肿和增生肥大。脏器指数减小则是发生了脏器萎缩和其他退行性变化[19]。由表2可知，在灌胃6 周后，小鼠心脏和脾脏的脏器指数没有差异。可是肝脏和肾脏的脏器指数却值得关注。肝脏中，中剂量、高剂量和阳性对照组相对于正常组脏器指数显著降低（P＜0.05）。肾脏中，高剂量相对于正常组脏器指数显著降低（P＜0.05）;阳性对照组相对于正常组极显著降低（P＜0.01）。对于肝脏和肾脏是否是出现了病变，还需要进一步的组织切片观察。针对目前得到的结果可知，丹酚酸B水溶性成分的主要靶器官是肝脏和肾脏。这与Li Xiaochuan等[20]在大鼠口服丹酚酸B后，得到丹酚酸B各组织中水平由高到低的顺序（肾＞肺＞肝＞心＞脾＞脑）相似。

2.4 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中SOD活力的影响

Wang Yingchun等[21]通过实验得到，丹酚酸B可以通过保护肝脏线粒体的方式，调节脂质代谢过程，治疗非酒精性脂肪性肝炎。丹酚酸B对CCl4诱导的大鼠肝纤维化也具有一定的抗肝损伤作用，减少肝脏胶原沉积和氧化损伤[22]。所以本实验只测定肝脏和血清中SOD活力，灌胃6 周丹酚酸B后，只有血清中阳性对照组相对于正常组显著增加;随着丹酚酸B剂量增加，肝脏和血清中的SOD活力同样增加（表3）。组别 肝脏SOD活力/（U/mg） 血清SOD活力/（U/mL）

表 3 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中SOD活力的影响（n＝ 3）Table 3 Effect of salvianolic acid B on SOD activity in liver and serum of mice (n= 3)

2.5 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中MDA水平的影响

组别 肝脏MDA含量/（nmol/mg） 血清MDA浓度/（nmol/mL）

表 4 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中MDA水平的影响（n＝ 3）Table 4 Effect of salvianolic acid B on MDA levels in liver and serum of mice (n= 3)

MDA是脂质过氧化产物，可用作评估氧化应激的指标[23]。由表4可知，在肝脏中，高剂量组相对于正常组MDA有显著性降低（P＜0.05），在血清中，中剂量组相对于正常组有显著性降低（P＜0.05），高剂量组和阳性对照组相对于正常组极显著性降低（P＜0.01）。说明丹酚酸B在中、高剂量时，和VC一样具有减轻机体受到氧化应激的功能。这与Chen Yonghong[24]和Ma[25]等得到的结果相似，他们指出丹酚酸B可以显著抑制脂质过氧化，并在缺血再灌注模型中增强SOD活性，提高GSH含量。

2.6 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中GSH含量的影响

表 5 丹酚酸B对小鼠肝脏和血清中GSH含量的影响（n＝ 3）Table 5 Effect of salvianolic acid B on GSH contents in liver and serum of mice (n= 3)

由表5可知，肝脏中GSH含量在各组中没有显著性变化，而在血清中、高剂量组GSH浓度显著增加（P＜0.05），相较于阳性对照组增加更多。

2.7 微生物群落差异分析结果

2.7.1 样品多样性指数分析结果

图 3 操作分类单元稀释性曲线Fig. 3 Rarefaction curves of operational taxonomic units

图 4 Rank abundance曲线Fig. 4 Rank abundance curves

如图3所示，各样品的稀释曲线已经趋于平缓，测序量远远大于曲线拐点量，说明本研究样本测序深度及覆盖度足够，其测序深度可以代表大多数微生物种类。如图4所示，Rank abundance曲线在水平横轴上的跨度较大，分类的丰富度较高。在垂直方向上曲线平缓，物种分布均匀。相对丰度高于10-3的菌种在各样本中都较少，随着菌群数量逐渐增加，样本丰度降低。在菌群丰度至10-5时，曲线接近平台期。大部分样品测得的菌属在400～600之间。

图 5 Shannon稀释曲线Fig. 5 Shannon rarefaction curves

如图5所示，各药物组均比正常组Shannon指数大，表示各药物组样品菌群丰富度增加，曲线趋于平缓，测序深度增加已经不影响物种多样性，测序量趋于饱和。

2.7.2 菌群组成分析结果

图 6 门水平下微生物种类分布图Fig. 6 Microbial composition at phylum level

如图6所示，在门分类水平下，给药组相对于正常组，除Firmicutes（厚壁菌门）上升外，Bacterbidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Verrucomicrobia（疣微菌门）、Actinobacteria（放线菌门），其他菌门相对丰度均下降。

图 7 种水平下微生物种类分布图Fig. 7 Microbial composition at species level

如图7所示，在种水平下给药组与正常组比较，主要是Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis两种菌相对丰度增加。给药组中Bacteroides uniformis菌相对正常组相对丰度降低，降低程度大于阳性对照组。

2.7.3 LEfSe菌群差异分析结果

图8A展示了不同组中丰度差异显著的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小（即为线性判别分析值）。随后通过将差异映射到已知层级结构的分类树上方式得到进化分支图（图8B）。在进化分支图中，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。筛选P＜0.05、LDA＞2的菌落进行展示和比较，如图8A1、B1所示，在灌胃低剂量的丹酚酸B后，肠道中拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门丰度均增加。在更加精确的分类水平下，拟杆菌门中Bacteroides vulgatus、Bacteroides thetaiotaomicron两个菌丰度增加明显。厚壁菌门中LachnospiraceaeFCS020 group、Ruminiclostridium6两个菌丰度增加明显。放线菌门中Gordonibacter丰度增加明显。如图8A2、B2所示，在灌胃中剂量的丹酚酸B后，肠道中拟杆菌门、厚壁菌门和绿弯菌门丰度均增加。在更加精确的分类水平下，拟杆菌门中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis两个菌丰度增加明显。厚壁菌门中mouse gut metagenome丰度增加明显。绿弯菌门Chloroflexi丰度也有所增加，可是具体属种并不知道。如图8A3、B3所示，在灌胃高剂量的丹酚酸B后，肠道中拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门丰度均增加。在更加精确的分类水平下，拟杆菌门中Bacteroides vulgatus，Parabacteroides distasonis两个菌丰度增加明显。厚壁菌门中mouse gut metagenome、Tyzzerella3、MollicutesRF9丰度增加明显。放线菌门中Gordonibacter丰度增加明显。图8A4、B4所示，在灌胃VC后，肠道中拟杆菌门、厚壁菌门丰度均增加。在更加精确的分类水平下，拟杆菌门中Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis丰度增加明显。厚壁菌门中Roseburia、MollicutesRF9丰度增加明显。

图 8 正常组和丹酚酸B各剂量组菌群差异分析Fig. 8 Analysis of differences between normal group and salvianolic acid B treatment groups

在灌胃低剂量和高剂量丹酚酸B实验组中，发现放线菌门中Gordonibacter菌丰度增加明显。该菌的两个菌种Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378 T）和Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213 T）具有将鞣花酸代谢为尿石素的功能[26-27]。尿石素A（urolithin A，UA）是由鞣花单宁在肠道菌群中生成的一种天然代谢产物[28]。UA可以抑制髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，MPO是一种在多形核中性粒细胞和巨噬细胞中表达的血红素蛋白，其含量在炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）[29]和其他炎症性疾病血浆中显著增加[28]。

在对比生理盐水组后，所有的药剂组中Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis丰度均有增加。根据Yoshida等[30]的研究可知，灌胃具有活性的B. vulgatus和B. dorei至小鼠体内，减弱动脉粥样硬化，明显改善内毒素血症。通过减少肠道微生物脂多糖的产生，保护小鼠免于动脉粥样硬化。

Parabacteroides distasonis的丰度增加对改善IBD[31]、多发性硬化[32]、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[33]和肥胖[34]有益处。通过体内、体外实验发现Parabacteroides distasonis具有很强的将原发性胆汁酸转化为二级胆汁酸的能力，所以该菌通过诱导胆汁酸代谢的变化改善ob/ob小鼠的脂质代谢过程并能减轻NAFLD程度[35]。Koh等通过实验发现Parabacteroides distasonis具有抗炎症和抗肿瘤的效果，Parabacteroides distasonis通过减弱Toll样受体4信号传导和阻断Akt活化，抑制小鼠结肠肿瘤的形成[36]。

3 结 论

在脏器指数统计中，肝脏和肾脏的脏器指数随剂量增加而下降。小鼠体内抗氧化指标检测结果显示，在没有构建损伤模型的情况下灌胃丹酚酸B，SOD活力只有增加的趋势，在肝脏和血清中，各剂量组相较于正常组没有显著性增加。相较于正常组，GSH活力只在血清高剂量组中具有显著性增加。相较于肝脏正常组，高剂量组MDA含量显著性降低;相较于血清正常组，中剂量组MDA含量显著性降低，高剂量组极显著性降低。因此，丹酚酸B具有治疗心血管疾病的作用。在口服丹酚酸B后，通过菌群差异分析发现Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis在给药组中丰度均增加，且差异显著。Parabacteroides distasonis具有抗炎抗肿瘤的功能，并参与胆汁酸的代谢过程。Bacteroides vulgatus可以抑制体内脂多糖的产生，改善动脉粥样硬化。

通过以上实验，可知丹酚酸B具有体内抗氧化活性，同时可以影响肠道菌群的构成，然而是否通过上述已知功能菌群发挥药理作用还需要进一步研究。