广藿香酮对脑卒中大鼠的影响及其作用机制

古长维，刘仲，武苗苗，辛红娟，党晓燕

脑卒中是由于脑血流减少或供氧不足导致脑组织死亡的急性脑血管疾病，可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中指动脉粥样硬化或血栓阻塞血管致使脑部血液供应中断；出血性脑卒中指血管破裂致使血液渗入大脑，进而破坏脑组织［1］。脑卒中具有高发病率、高致残率、高病死率及高复发率的特点［2-3］，其中缺血性脑卒中发病率约占脑卒中患病人数的60%～70%。目前临床上关于脑卒中尚缺乏有效的治疗方法，常以预防为主［4］。广藿香提取物广藿香酮（POG）具有抗癌、抗炎、抗菌等多重药理作用［5-6］，常用于心血管疾病、糖尿病、肝炎等多种疾病的预防［7］，且其在前列腺癌、白血病和胆囊癌等恶性肿瘤中具有明显的抗肿瘤作用［8-10］。相关研究表明，POG可通过抑制机体Livin蛋白表达、激活B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）而促进线粒体细胞色素C释放，进而活化半胱氨酸天冬酶3（caspase-3），导致DU145细胞凋亡，而细胞凋亡基因如Bcl-2、caspase-3等与高血压密切相关［11］。既往关于POG治疗脑卒中的报道较少。本研究旨在探讨POG对脑卒中大鼠的影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验于2018年12月—2019年4月完成。选取7～8周龄SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体质量150～170 g，由西安交通大学动物研究中心提供（许可证号：SCXK新2018-0076）。大鼠均在西安交通大学动物房SPF级适应性饲养1周，动物房温度20～26 ℃，湿度40%～70%，人工光照、阴暗各12 h，整个实验过程中大鼠均可自由进食和饮水。

1.2 主要药物、试剂及仪器

1.2.1 主要药物 POG（四川省维克奇生物科技有限公司生产，CAS号：23800-56-8，纯度≥98%），水合氯醛（成都德思特生物技术有限公司生产）。

1.2.2 主要试剂 超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（上海一研生物科技有限公司生产），丙二醛（MDA）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉默沙克生物科技有限公司生产），一氧化氮（NO）试剂盒（上海岚派生物科技有限公司生产），聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）凝胶配制试剂盒（西安赫特生物科技有限公司生产），TRIzol试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司生产），Rabbit anti-Bcl-2（Sino Biolgical），Rabbit anti-VEGF（Sino Biolgical），Rabbit anti-Bax（Sino Biolgical），Rabbit anti-GAPDH（Sino Biolgical），LY294002（德国达姆施塔特默克公司生产），反转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）试剂盒（Thermo Fisher Scientific生产）。

1.2.3 主要仪器 光学显微镜（上海无陌光学仪器有限公司生产），高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific生产），低温离心机（湖南凯达科学仪器有限公司生产），微量分光光度仪（梅特勒-托利多国际有限公司生产），化学发光仪（Bio-Rad公司生产）。

1.3 实验方法

1.3.1 建模 采用线栓法阻断大鼠大脑中动脉血流以制备脑卒中模型，具体方法如下：大鼠经10%水合氯醛进行腹腔麻醉后仰卧固定于平板上，给予碘伏消毒，于大鼠颈部正中做一切口，而后分离颈部右侧皮下组织和腺体，沿右侧胸锁乳突肌腱向下探寻颈动脉并对颈总动脉近端、远端颈外动脉进行结扎，在其颈总动脉分叉部或颈外动脉残端插入直径为0.26 mm的鱼线并以插入约18 mm直至有阻塞感为宜，再采用血管夹夹闭颈内动脉近端；最后在颈部切口缝合前结扎颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分叉处，固定闭合线［12］。大鼠禁食12 h。

1.3.2 分组 将36只大鼠随机分为空白对照组（未经模型诱导，n=6）、对照组（建模后未经治疗，n=6）、低剂量组（建模24 h后给予POG 5 mg/kg，n=6）、中剂量组（建模24 h后给予POG 15 mg/kg，n=6）、高剂量组（建模24 h后给予POG 45 mg/kg，n=6）和LY294002组（建模24 h后给予0.1%～0.3%二甲亚砜溶解至浓度为0.1%，n=6）。

1.4 观察指标

1.4.1 磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化AKT（p-AKT）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白相对表达量 采用Western blot法检测六组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量，具体操作如下：按照SDSPAGE凝胶配制试剂盒说明书配置凝胶，确保六组大鼠蛋白样量相同；根据marker标志切割目的蛋白所在区域凝胶，将浓缩胶转固相载体如聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后孵育p-PI3K、p-AKT、p-eNOS第一抗体并置于4 ℃冰箱中过夜，次日孵育第二抗体1 h，再次洗膜并将PVDF膜置入化学发光仪的暗盒中显示蛋白条带，以目的基因蛋白条带的灰度值与内参基因GAPDH的灰度值比值为目的蛋白相对表达量。

1.4.2 Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及其mRNA相对表达量 分别采用Westren blot法、RT-qPCR方法检测Bcl-2、Bax、VEGF蛋白、mRNA相对表达量，Westren blot法具体操作与上述一致，RT-qPCR方法具体如下：首先，按照TRIzol试剂盒说明书提取大鼠组织总RNA并采用2-ΔΔCq方法进行定量；其次，按照RT-qPCR试剂盒说明书配置25 μl的反应体系（包括10 μl Total RNA，2.5 μl 10×DNaseI Buffer，20 U RNase Inhibitor，1 μl RNase-free，11 μl DEPC处理水）将RNA合成cDNA，取cDNA；再配置25 μl的总PCR反应体系（包括 17.5 μl ddH2O，2.5 10×buffer，2 μl dNTP，0.2 μl Taq DNA聚 合 酶，1 μl Forward primer，1 μl Reverse primer）扩增cDNA，按照95 ℃初始变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s的程序反应进行40个循环，根据循环阈值计算Bcl-2、Bax、VEGF的mRNA相对表达量。基因引物序列见表1。

1.4.3 SOD、MDA、NO水平 分别采用SOD试剂盒、MDA ELISA试剂盒、NO试剂盒检测六组大鼠大脑皮质和外周血SOD、MDA及NO水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

表1 Bcl-2、Bax、VEGF引物序列Table 1 Primer sequences of Bcl-2，Bax and VEGF

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0（International Business Machines Corporation，IBM）统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量 六组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中高剂量组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量低于对照组，p-AKT和p-eNOS蛋白相对表达量高于LY294002组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 六组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量比较（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

表2 六组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量比较（±s，μg/ml）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in the six groups

注：p-PI3K=磷酸化PI3K，AKT=磷酸化AKT，p-eNOS=磷酸化内皮型一氧化氮合酶；与对照组比较，aP＜0.05；与高剂量组比较，bP＜0.05

组别 只数 p-P13K p-AKT p-eNOS空白对照组 6 0.19±0.01 0.20±0.01 0.18±0.01对照组 6 0.79±0.02 0.77±0.02 0.71±0.03低剂量组 6 0.57±0.01 0.59±0.01 0.59±0.01中剂量组 6 0.54±0.01 0.49±0.01 0.39±0.01高剂量组 6 0.36±0.02a 0.38±0.02a 0.38±0.02a LY294002 组 6 0.39±0.02 0.27±0.01b 0.23±0.01b F值 4.03 3.23 4.68 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相对表达量六组大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中高剂量组大鼠Bcl-2蛋白相对表达量高于对照组，Bax、VEGF蛋白相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组大鼠Bcl-2、VEGF mRNA相对表达量高于对照组，Bax mRNA相对表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

2.3 大脑皮质和外周血NO、MDA、SOD水平 六组大鼠大脑皮质和外周血NO、MDA、SOD水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组大鼠大脑皮质和外周血NO、SOD水平高于对照组，大脑皮质和外周血MDA水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组大鼠大脑皮质和外周血MDA水平高于LY294002组，大脑皮质和外周血SOD水平低于LY294002组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

3 讨论

PI3K是一种由趋化因子受体激活的信号传导酶［13］。既往研究表明，PI3K能与C5a受体结合形成激动剂而激活多种信号蛋白［14］。PI3K抑制剂虫草素与LY294002均可抑制趋化剂诱导的巨噬细胞的趋化性［15-16］，其中PI3K活化主要与靠近其质膜内侧底物有关。多种生长因子和信号转导复合物如成纤维细胞生长因子（FGF）、VEGF、人生长因子（HGF）、血管生成素1（Ang1）和胰岛素等均能激活PI3K，也可通过激活受体酪氨酸激酶（RTK）引起自磷酸化［17］。PI3K激活导致第二信使质膜内磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）产生，该蛋白可与信号蛋白AKT和磷酸肌醇依赖激酶1（PDK-1）结合，进而诱导AKT中Ser308磷酸化，激活AKT［18］。AKT激活IκB激酶（IKKα）可降解NF-κB的抑制剂IκB，从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位，通过激活其靶基因而提高细胞存活率［19］。本研究结果显示，高剂量组大鼠p-PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白相对表达量低于对照组，p-AKT和p-eNOS蛋白相对表达量高于LY294002组，提示POG、LY294002均可使脑卒中大鼠PI3K/AKT信号通路受到抑制，究其原因可能为高剂量POG的作用方式与LY294002相似，均可抑制PI3K、AKT磷酸化。

表3 六组大鼠Bcl-2、Bax、VEGF蛋白及其mRNA相对表达量比较（±s，μg/ml）Table 3 Comparison of relative protein and mRNA expression quantity of Bcl-2，Bax and VEGF in the six groups

注：与对照组比较，aP＜0.05

组别 只数 蛋白相对表达量 mRNA相对表达量Bcl-2 Bax VEGF Bcl-2 Bax VEGF空白对照组 6 0.40±0.01 0.08±0.02 0.07±0.01 0.036±0.001 0.001±0.000 0.017±0.003对照组 6 0.01±0.01 0.80±0.01 0.36±0.02 0.005±0.002 0.004±0.001 0.003±0.001低剂量组 6 0.11±0.02 0.69±0.02 0.34±0.01 0.006±0.002 0.003±0.001 0.004±0.001中剂量组 6 0.18±0.01 0.20±0.01 0.28±0.02 0.012±0.001 0.002±0.001 0.006±0.001高剂量组 6 0.25±0.01a 0.17±0.02a 0.19±0.01a 0.017±0.002a 0.002±0.001a 0.012±0.001a LY294002 组 6 0.28±0.02a 0.18±0.01a 0.07±0.01a 0.027±0.002a 0.002±0.001a 0.016±0.001a F值 3.06 2.76 2.94 3.19 2.26 4.15 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表4 六组大鼠大脑皮质和外周血NO、MDA和SOD水平比较（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

表4 六组大鼠大脑皮质和外周血NO、MDA和SOD水平比较（±s）Table 4 Comparison of NO，MDA and SOD in cerebral cortex and peripheral blood in the six groups

注：NO=一氧化氮，MDA=丙二醛，SOD=超氧化物歧化酶；与对照组比较，aP＜0.05；与高剂量组比较，bP＜0.05

组别 只数 NO（μmol/g） MDA（nmol/ml） SOD（U/mg）大脑皮质 外周血 大脑皮质 外周血 大脑皮质 外周血空白对照组 6 7.13±0.04 13.32±3.61 4.97±0.01 11.82±2.28 136.51±16.31 160.31±32.85对照组 6 0.83±0.01 3.49±0.05 13.25±4.32 19.45±3.16 68.61±13.92 50.64±3.6低剂量组 6 0.84±0.01 3.65±0.04 9.28±2.12 19.19±2.76 69.37±12.83 46.72±5.93中剂量组 6 4.16±0.01 6.16±0.03 7.35±3.28 16.08±1.92 90.58±20.06 69.32±3.86高剂量组 6 4.95±0.01a 8.34±0.04a 5.09±1.54a 14.11±4.38a 116.82±40.31a 92.34±31.30a LY294002 组 6 5.18±0.01 10.25±0.02 4.99±0.59b 10.37±2.06b 126.28±5.27b 127.29±2.14b F值 3.54 4.39 4.28 5.36 10.54 12.82 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

MDA是一种脂质过氧化物，是检测细胞氧化损伤的重要指标，可反映自由基对组织和细胞的损伤程度；SOD是一种内源性抗氧化酶，可抑制活性氧簇（ROS）产生，可反映机体清除氧自由基的能力。既往研究表明，ROS在脑卒中所致脑组织损伤中具有重要作用。缺血再灌注组织中产生的ROS可被代谢为前列腺素和白三烯，导致白细胞趋化并控制血管内皮细胞功能［20］。本研究结果显示，高剂量组大鼠大脑皮质和外周血SOD水平高于对照组、LY294002组，大脑皮质和外周血MDA水平低于对照组、LY294002组，提示大剂量POG对脑卒中大鼠脑组织脂质过氧化有保护作用。

NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化L精氨酸（L-Arg）末端胍基氮氧化而成［21］。NO与心血管、神经、胃、肾和肝脏疾病密切相关［22］，其是一种新的免疫分子和炎性递质，可介导内毒素、肿瘤坏死因子（TNF）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）等细胞因子。eNOS既可产生NO扩张血管，还可产生超氧化物收缩血管。既往研究表明，谷胱甘肽化修饰参与氧化应激过程，是eNOS氧化还原的开关［23］。相关研究表明，高血压患者血管NO增多，与血管扩张功能受损有关［24］。这种氧化应激也同时发生在心脏病发作、脑卒中、糖尿病和癌症中，提示为恢复NOS的正常功能而对这种氧化还原开关进行复位可能是一种潜在的治疗方法。本研究结果显示，高剂量组大鼠大脑皮质和外周血NO水平高于对照组，提示高剂量POG可减轻脑卒中大鼠脑组织损伤。本研究结果还显示，低、中、高剂量组各指标间无统计学差异，表明脑卒中大鼠对POG无剂量依赖性。

综上所述，POG可通过抑制PI3K/AKT-eNOS信号通路及脂质过氧化而减轻脑卒中大鼠脑组织损伤，具有抗细胞凋亡、保护血管等作用，且无剂量依赖性；但本研究纳入样本量有限，可能会对实验结果造成影响，后期仍需扩大样本量继续深入研究。

作者贡献：古长维进行文章的构思与设计，撰写沦为；刘仲、武苗苗进行研究的实施及可行性分析；辛红娟进行数据收集、整理、分析；党晓燕进行结果的分析与解释，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理；刘仲、武苗苗、辛红娟负责论文的修订。

本文无利益冲突。