AKT-GSK-3β信号转导通路调控吉西他滨对肝癌细胞化疗敏感性的研究

任庆 熊锐华 黎辉 黄林 蒋小月 赵晓莉

(桂林医学院第二附属医院 广西 桂林 541199)

本研究对AKT-GSK-3β信号转导通路调控吉西他滨对肝癌细胞化疗敏感性进行了研究。

1.资料与方法

1.1 研究对象

采用SMMC-7721传代肝癌细胞、HepG2传代肝癌细胞。

1.2 主要试剂与仪器

高糖DMEM、胎牛血清、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、0.25%胰蛋白酶、蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉、0.45nm PVDF膜、ECL发光显影液，Bio-rad Image Lab凝胶成像系统、电泳仪、细胞培养箱、离心机、生物安全柜。

1.3 方法

1.3.1肝癌细胞培养 将完全培养液制作出来，其包含青链霉素+10%胎牛血清+高糖DMEM，在37℃ 5%CO2培养箱中对HepG2细胞、SMMC-7721细胞进行培养，将对数生长期细胞取出来进行实验[1]。

1.3.2吉西他滨作用后肝癌细胞凋亡检测 将对数生长期的HepG2细胞、SMMC-7721细胞取出来，分别将细胞悬液制作出来，在六孔板中加入2.5×105个/孔数量。在细胞融合率在50%-70%之间时，用20μg/ml吉西他滨分别进行18h作用。Western blot对肝癌细胞中BAX、Bcl-2蛋白表达情况进行检测。

1.3.3 吉西他滨作用下肝癌细胞AKT/GSK-3β通路激活检测

用吉西他滨在肝癌细胞作用，Western blot对总AKT、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达情况进行检测。

1.3.4阻断通路后肝癌细胞凋亡情况 吉西他滨作用前1h用PI3K/AKT特异抑制剂LY294002将该通路阻断，然后用吉西他滨在肝癌细胞作用，再次进行Westren blot对肝癌细胞中BAX、Bcl-2蛋白表达情况进行检测，以对化疗效果受到AKT/GSK-3β信号通路的影响进行观察。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 吉西他滨化疗后肝癌细胞凋亡相关蛋白表达情况，见表1。

表1 吉西他滨化疗后肝癌细胞凋亡相关蛋白表达情况分析（±s）

表1 吉西他滨化疗后肝癌细胞凋亡相关蛋白表达情况分析（±s）

肝癌细胞 时间Anti-Bcl-2Anti-BAXAnti-GAPDH SMMC-7721化疗前1.00±0.311.01±0.321.00±0.30化疗后0.49±0.123.00±1.000.94±0.31 HepG2化疗前1.00±0.331.00±0.121.00±0.24化疗后0.31±0.102.74±0.910.96±0.31

2.2 吉西他滨诱导AKT/GSK-3β信号通路蛋白表达情况，见表2。

表2 吉西他滨诱导AKT/GSK-3β信号通路蛋白表达情况（±s）

表2 吉西他滨诱导AKT/GSK-3β信号通路蛋白表达情况（±s）

肝癌细胞 时间Anti-p-AKTAnti-AKTAnti-p-GSK-3βser9Anti-GAPDH SMMC-7721化疗前1.00±0.311.01±0.321.02±0.301.00±0.30化疗后3.01±1.001.01±0.302.69±0.811.02±0.32 HepG2化疗前1.00±0.311.01±0.321.00±0.301.01±0.32化疗后3.71±1.201.41±0.411.12±0.303.01±1.00

2.3 阻断AKT/GSK-3β通路后化疗肝癌细胞凋亡情况，见表3。

表3 阻断AKT/GSK-3β通路后化疗肝癌细胞凋亡情况（±s）

表3 阻断AKT/GSK-3β通路后化疗肝癌细胞凋亡情况（±s）

肝癌细胞 时间Anti-Bcl-2Anti-BAXAnti-GAPDH SMMC-7721化疗前1.00±0.311.01±0.321.00±0.30化疗后0.76±0.231.50±0.420.96±0.31阻断后0.50±0.132.25±0.710.92±0.30 HepG2化疗前1.00±0.331.00±0.121.00±0.24化疗后0.50±0.121.25±0.401.13±0.31阻断后0.25±0.082.54±0.821.10±0.30

3.讨论

本研究结果表明，吉西他滨化疗后SMMC-7721、HepG2的Anti-Bcl-2、Anti-GAPDH显著低于化疗前；而Anti-BAX表达均显著高于化疗前（P＜0.05）见表1。吉西他滨化疗后SMMC-7721、HepG2的Anti-p-AKT、Anti-p-GSK-3βser9表达均显著高于化疗前（P＜0.05）。化疗前、化疗后、阻断后SMMC-7721、HepG2的Anti-Bcl-2表达均逐渐降低（P＜0.05），Anti-BAX表达均逐渐升高（P＜0.05），见表2，和相关医学研究结果一致[2]。

综上所述，AKT-GSK-3β信号转导通路调控吉西他滨对肝癌细胞化疗敏感性高，值得进一步深入研究。