“三法三穴”对坐骨神经损伤大鼠背根神经节中cAMP及PKA表达的影响

罗宇婷 莫岩君 吕桃桃 沈熠 邵帅 张羽墨 于天源

推拿作为中医治疗周围神经损伤的常用方法，临床疗效好，不良反应小。大量研究证明，以三法三穴为代表的推拿手法可以有效促进SNI大鼠受损神经及后肢肌力的恢复。cAMP-PKA信号通路作为目前研究最深入的信号通路之一，在周围神经损伤过程中发挥了重要作用，尤其是在促进轴突及髓鞘再生、调节生长锥、促进NGF表达等方面。在以三法三穴为代表的推拿手法恢复周围神经损伤的起效机制中，是否有cAMP及PKA的参与，是探究推拿治疗周围神经神经损伤机理的重要环节。本研究观察“三法三穴”推拿治疗对坐骨神经损伤(sciatic nerve injury，SNI)大鼠背根神经节内cAMP及PKA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠32只，体质量(200±10)g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。购入后适应性饲养1周。所有实验程序均符合动物福利与伦理原则，并经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准。

1.2 药物与试剂

2 mg/mL BSA标准品(索莱宝，PC0001)；彩虹245广谱蛋白Marker(12条带)(索莱宝，PR1920)；水合氯醛(沪试公司)；BCA蛋白定量试剂盒(索莱宝，PC0020)；10×TBST pH 8.0(索莱宝，T1081)、兔源cAMP抗体(Abcam公司，英国,ab76238)、兔源PKA抗体(Abcam Company，英国，ab32390)。

1.3 主要实验仪器

按摩推拿手法模拟仪(中华人民共和国发明专利号200710187403.1)；电泳仪(美国BIO-RAD公司，美国，10002468)；Mini-P-2电泳槽(BIO-RAD公司，美国，10007296)；MultiSkan3酶标仪(美国Thermo公司，1410101)；水平脱色摇床(六一公司，WD-9405FN)； Fresco低温冷冻离心机(Thermo公司，美国，75007406)；电动组织匀浆器(Fluka公司，美国)。

1.4 造模与干预方法

1.4.1 造模方法 用随机数字表法将大鼠分为正常组16只、假手术组16只、模型组16只、推拿组8只。先将大鼠用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g体重的剂量腹腔注射麻醉；然后俯卧位固定于消毒过的鼠板上，手术区(右侧臀股交界处)备皮、常规消毒，用手术剪沿坐骨神经走行方向剪开大约1 cm的皮肤切口，然后用止血钳钝性逐层分离肌肉，暴露梨状肌下缘及坐骨神经；用弯钩镊确认所暴露的组织确为坐骨神经后，用特制无齿10号持针器在距梨状肌下缘5 mm处满扣夹持坐骨神经5秒，然后逐层缝合，碘伏消毒。假手术组：预处理及显露坐骨神经的方法同造模组，但不做夹持。正常组不造模；三法三穴组同模型组。

1.4.2 穴位及推拿仪器的选取 干预的穴位为殷门、承山及阳陵泉穴。在本次实验中，除从针灸学角度考虑此三穴为同时刺激穴位―神经―肌肉的最佳点外；从推拿学角度分析，此三穴在临床中属常用穴及强刺激穴。此外，从实验动物及干预手法考虑，此三穴有较强的可操作性。按摩推拿手法模拟仪：运用模拟仪进行定性定量推拿手法操作。

1.4.3 干预方法 各组均在造模后第7天开始干预。推拿组使用手法模拟仪依次刺激束缚后大鼠右侧“殷门”“承山”“阳陵泉”，其中“殷门”位于后肢上段正中，“阳陵泉”位于后三里上外侧5 mm(后三里位于膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处)，“承山”位于后肢腓肠肌两肌腹形成凹陷处；手法模拟为点法、拨法、揉法；刺激力量为4 N。每穴每法1分钟，频率30次/分钟，总计9 min。正常组、假手术组、模型组仅抓取，不作干预。治疗次数：每天1次，每治疗7次休息1天。

1.5 指标观测与检测方法

1.5.1 行为学检测 应用改良Rivlin法制倾斜板，记录行为学评分，每只大鼠重复测量3次，取平均值。各组分别于术后7天和干预20天时做斜板实验行为学评分。

1.5.2 标本采集 正常组、假手术组、模型组分别于术后第7天和干预20天时，三法三穴组于干预20天时，每组选取8只大鼠处死。迅速置于冰盘上，取L4～L6节段背根神经节，放于液氮罐中冷冻，后转移至-80℃冰箱中保存备用。

1.5.3 DRG中cAMP、PKA蛋白表达 每组8个样本进行检测。组织加入3 mL预冷的RIPA裂解液充分研磨，12000 rpm低温离心15 min后取上清液。用BCA蛋白定量试剂盒测定各样本蛋白浓度后，确定蛋白上样量约10 μg，加入5倍SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。目标蛋白上样后电泳，20分钟80 V，1小时100 V。转膜时操作条件为2小时120 V。加入5%脱脂牛奶封闭1小时后，1×TBST每10 min洗1次，共洗3次。将PVDF膜按蛋白分子量剪开，分别加入一抗cAMP抗体(1∶50000)、一抗PKA抗体(1∶3000)、一抗CREB (1∶3000)及Anti-N Cadherin(1∶3000)，摇床上室温孵育60 min后4℃过夜。洗膜，1×TBST每10 min洗1次，共洗3次。所得的印迹经二抗HRP-羊抗兔IgG (1∶3000)室温摇床孵育60 min。1×TBST每10 min洗1次，洗3次。然后使用ECL试剂盒曝光显影，条带曝光完毕后，PVDF膜自然晾干后封存。应用Quantity One分析软件计算目标条带积分光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 斜板实验

术后7天时，模型组大鼠斜板实验评分明显低于正常组(P<0.05)，假手术组大鼠斜板实验评分与正常组无显著性差异(P>0.05)；干预20天时，三法三穴组大鼠斜板实验评分与模型组比较明显升高(P<0.05)。结果见表1。

表1 术后7天与干预20天时各组大鼠斜板实验结果(单位：度；

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.2 各组大鼠DRG中cAMP的表达情况

术后7天时，与正常组比较，模型组表达水平显著降低(P<0.05)；干预20天时，与模型组相比，三法三穴组cAMP表达水平呈明显升高趋势，三法三穴组与模型组相比差异显著(P<0.05)。结果见表2，图1。

表2 术后7天与干预20天时各组大鼠DRG中cAMP的蛋白表达

注： 与正常组比较，aP>0.05；与模型组比较，bP>0.05。

2.3 各组大鼠DRG中PKA表达比较

术后7天，与正常组比较，模型组PKA表达水平显著降低(P<0.05)；干预20天后，与模型组比较，三法三穴组PKA表达水平显著上升(P<0.05)，且三法三穴组与正常组相比无明显差异(P>0.05)。结果见表3，图2。

注：A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：三法三穴组。图1 术后7天与干预20天时各组大鼠DRG组织cAMP的蛋白表达

表3 术后7天与干预20天时各组大鼠DRG中PKA的蛋白表达

注： 与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

注：A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：三法三穴组。图2 术后7天与干预20天时各组大鼠DRG中PKA的蛋白表达

3 讨论

3.1 干预手法及方式

杨超[1]运用Meta分析推拿治疗原发性及继发性坐骨神经病变手法选择时，纳入的RCTs涉及14种手法，以使用频次从高到低排序，同时依照治疗中以放松类手法为主配合温通类手法的原则，本实验选择了最常用的点、拔、揉三种手法。另实验中以按摩推拿手法模拟仪(中华人民共和国发明专利号200710187403.1)进行操作。通过专利仪器的使用，达到了对“三法三穴”干预手法定量的要求，保证了实验结果的可信度和科学性。

3.2 推拿治疗坐骨神经损伤的机制日益明确

前期研究表明，以三法三穴为代表的推拿手法治疗周围神经损伤疗效确切。主要表现为：对腓肠肌细胞直径的恢复[2]，神经髓鞘的修复[3]，轴突的再生[4-5]；减缓神经元凋亡[6]，细胞骨架的再建[7]，NTF相关因子(NGF、BDNF、CNTF等)在肌肉、神经、脊髓中表达升高[8]；提高马达蛋白kinesin及dynein在脊髓中的表达，促进轴浆运输功能恢复，终改善坐骨神经损伤大鼠的运动及感觉功能[9]。

3.3 cAMP-PKA信号通路在多方面促进周围神经损伤恢复

cAMP-PKA信号通路在改善神经元内环境、抑制或中和神经元内的抑制因子、轴突生长锥导向和致靶过程中轴突投射的准确性以及促进髓鞘修复和雪旺细胞有丝分裂等多方面影响轴突生长。Cai等[10]发现脑源性神经营养因子(BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，可以增加cAMP的含量，激活PKA，轴突在接触MAG之前暴露于BDNF和GDNF使cAMP水平升高，可以阻碍MAG的抑制作用；而加入PKA抑制剂后，BDNF和GDNF对轴突再生的促进作用消失。Cui等[11]证实向大鼠眼球内注射cAMP和睫状神经细胞营养因子，能增强大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglial cells，RGC)的生存能力和促进轴突再生长；而注射神经营养因子4/5(NTF-4/5)和同量的cAMP，仍可增强RGC的生存能力，但对远期轴突再生有抑制作用。这些研究提示cAMP与适当的神经营养因子联合对促进不同类型的轴突再生有协同作用；同时，cAMP-PKA信号通路参与生长锥导向的调节。Chierzi等[12]证实增加cAMP能促进成年人DRG和RGC轴突生长锥的出芽和再生，是由PKA介导的。Radwan等[13]发现BDNF、GDNF或NTF-3的梯度可吸引体外培养的神经元的生长锥，当分别抑制cAMP和PKA时，这种吸引转变为排斥，证明相关神经营养因子对生长锥的吸引作用是经cAMP-PKA信号通路介导的，这些形态学改变(生长锥出芽)与细胞分子水平机制(细胞骨架结构的改变)是一致的。Jin M[14]通过切断脊神经后根的体外模型观察到，大多数成人脊神经后根神经节的轴突在横切术4 h后形成新的生长锥；Qiu[15]在活体内抑制PKA的活性，将影响损伤轴突生长锥的出芽。可以发现，cAMP和PKA可以但不限于从促进轴突再生和生长锥出芽等方面修复受损的周围神经。虽然现有研究无法在时空上确切说明二者表达变化的先后顺序，但大量文献已经证实PKA作为cAMP的下游效应子，二者在周围神经损伤修复过程中表达变化趋同，且作用相似。

Aglah等[16]在实验中发现，细胞内cAMP的上调增加运动神经元中的神经突向外生长，而拮抗cAMP导致培养的大鼠运动神经元中神经突向外生长显著减少，这一变化直接影响了周围神经损伤大鼠后肢肌力与运动功能的恢复情况。因此可以明确，cAMP在大鼠周围神经损伤后运动神经元的再生过程中起到了至关重要的作用。

Walikonis等[17]在研究中发现，cAMP水平在受伤后会发生显著变化，当坐骨神经受到压迫或永久性横断损伤后，其表达量会下降，并且在髓鞘再生时表达增加。因此cAMP水平主要反映了该信使的合成和降解之间的净平衡。Ketty等[18]发现分离的施万细胞(SCs)通过采用分化的有丝分裂后状态响应cAMP升高，该状态表现出高水平的Kelx-20(髓鞘形成的转录增强子)和成熟的SC标记物如髓鞘脂质半乳糖脑苷脂。因此当cAMP表达升高后，也可以通过对施万细胞进行影响从而高效促进受损周围神经的修复。杜旭等[19]发现注射咯利普兰(PDE-IV的特异性抑制剂)可提高DRG细胞内cAMP水平，当cAMP表达水平上升时会显著加速周围神经再生。可以发现，通过其他干预手法可以提高cAMP的表达从而促进周围神经的再生和修复。结合本实验结果，坐骨神经钳夹模型造成坐骨神经损伤后，会表现出cAMP含量的下降；在推拿干预后其表达量明显增高。因此以三法三穴为代表的推拿手法对促进cAMP蛋白的表达升高作用十分明显且推拿确实通过影响cAMP蛋白及其通路的表达，起到了提高大鼠患侧肢体的后肢功能的作用，同时促进损伤坐骨神经的修复，且效果显著。

研究表明，cAMP也显着影响神经元和雪旺细胞的生物学行为，如轴突生长，雪旺细胞增殖和轴突髓鞘再生。鉴于cAMP对神经元和雪旺细胞的关键作用，已经研究了cAMP对周围神经再生的直接作用。通过注射毛喉素(一种增强cAMP生成的AC刺激物[20])原位增加神经元cAMP水平[21]，导致感觉神经再生率持续升高；在周围神经再生促进类似角色也可以通过用cAMP类似物(二丁酰cAMP和8-溴cAMP)和/或PDE抑制剂(茶碱)实现[22-23]。cAMP涉及许多神经元改变的过程，包括细胞培养中的诱导、分化、神经突向外生长和神经元存活[24-25]以及体内制剂影响下cAMP含量改变导致的神经元变化[26]。

Howe等[27]发现PKA调节的活性十分广泛，尤其是对MF、MT和细胞骨架相关蛋白的调节。PKA作为cAMP的必需下游靶标，Yu等[28]发现在神经递质、激素、应激和炎性刺激诱导的鸟苷结合蛋白偶联受体(GPCR)的激活后，细胞内cAMP水平增加并且其下游效应子PKA被激活。因此在实验中可以观察到，在术后7天及20天两个检测时间点，cAMP和PKA表达的变化趋势是相同的。cAMP的信号系统的中间体，如蛋白激酶A(PKA)和被cAMP激活的交换蛋白(EPAC)已经被报道在体内[29]和体外[30]均有调节髓鞘形成的作用。其中，Ketty等[31]发现PKA促进施旺细胞的增殖和分化、EPAC雪旺细胞分化和髓鞘形成。在雪旺细胞(SCs)中，cAMP不仅诱导分化为髓鞘SC相关表型，而且协同增强生长因子(如神经调节蛋白)的促有丝分裂作用，并且cAMP的促有丝分裂作用仅依赖于PKA活性。因此在实验中可以发现，PKA在坐骨神经损伤后表达下降，并且在cAMP表达增加后，PKA作为下游效应子表达随之增加，二者协同发挥作用，促进周围神经损伤的修复。因此，以三法三穴为代表的推拿治疗在促进PKA蛋白表达、激活cAMP-PKA信号通路以促进坐骨神经修复的过程中发挥了重要作用。

因此通过本次研究可以表明，斜板实验证明以三法三穴为代表的推拿手法可以有效提高SNI大鼠后肢肌力及运动功能的恢复；同时Western blot表明三法三穴为代表的推拿手法通过提高SNI大鼠DRG中cAMP和PKA的表达量，使其同时发挥作用，激活cAMP-PKA信号通路，修复受损神经。

4 展望

在本实验中，无形态学部分，在未来的研究中，可以结合形态学实验以进一步观察推拿治疗周围神经损伤在激活cAMP-PKA信号通路后具体以何种方式进行修复。可以从轴突的再生，髓鞘修复、生长锥的萌芽及导向调节等多方面观察，以明确cAMP-PKA信号通路是否以一种或多种方式同时对受损的周围神经进行修复。