基于叶绿体rbcL序列扩增的天南星药材及其常见混伪品的分子鉴定研究

许贞 刘春生 胡小松 隋丞琳 崔秀梅 侯凤祥 顾选

药材天南星为天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott、异叶天南星ArisaemaheterophyllumBl.或东北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥块茎，性温，味苦辛，归肺、肝、脾经，具有散结消肿的功效[1]。天南星药材通常被加工成制天南星或胆南星饮片，具有化痰、息风止痉等功效，常用于顽痰咳嗽、风痰眩晕、中风痰壅、口眼斜等症[2]，临床需求量大。此外，天南星入药能够起到祛痰、抗炎以及散结消肿的作用，所以其常用于抗肿瘤药物组方之中。有研究表明，鲜天南星水提取物可对小鼠子宫纤维瘤起到一定的抑制作用[3]，且不同来源的天南星外用对大鼠外伤性血瘀有很好的治疗作用[4]。由于天南星科植物众多，全国各地用药习惯不同，往往就地取材入药，本草记载也存在同名异物，同物异名等情况，导致中药材天南星的市场基原混乱，很难辨别。市场上，天南星主流基原为天南星A.erubescens，除正品天南星外，常有天南星科其他种类如半夏属掌叶半夏Pinelliapedatisecta、半夏Pinelliaternata、菖蒲属菖蒲Acoruscalamus、千年健属千年健Homalomenaocculta等充作天南星用或混淆使用。天南星科植物多有毒，毒性反应主要表现对口腔、咽喉及皮肤黏膜有很强的刺激性[5]，且不同物种毒性强度不同。吴紫君等[6]研究结果表明，天南星科3种有毒中药天南星、半夏、白附子生品均有明显的急性毒性，其中以生半夏毒性最强。因此，正品天南星的正本清源和准确鉴定对于用药安全显得十分重要。

目前，天南星真伪鉴别的方法除性状[7]外，还有薄层鉴别法[8]、指纹图谱鉴别法[9-10]、近红外光学鉴别[11-12]等方法。虽然传统的鉴别方法能够对天南星进行鉴别，但鉴别方法复杂，适用范围较窄，且结果易受到产地、采摘时间、储存条件等因素的影响，具有一定的局限性。而传统性状鉴别需要极大的工作经验积累，无法快速普及。因此，为保证中药材临床用药的安全、有效性，亟需建立一种稳定、快速、准确的鉴别方法。自2003年首次提出“DNA条形码”这一概念，DNA条形码分子鉴定技术飞速发展，为传统形态分类学带来了新的发展机遇[13-14]。DNA条形码技术作为一种新兴的鉴定技术，可用于中药材的基原鉴定，并且具有快速、准确的特点。陈士林等[15]基于大样本量实验创建了中药材DNA条形码分子鉴定体系，并提出中药材DNA条形码分子鉴定指导原则。目前该指导原则已纳入《中华人民共和国药典》(2015版)。近年来DNA条形码技术在中药真伪鉴别中应用越来越广[16-17]。

本研究收集市场天南星正品及其常见混伪品，运用分子鉴定技术，采用叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大亚基(Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase large subunit，rbcL)基因序列引物对其进行扩增、测序，结合Genbank数据库，通过计算种内、种间K2-P遗传距离及构建N-J树对不同样品进行鉴定，旨在对天南星药材及其常见混伪品进行准确鉴别，为市场上的天南星药材的质量评价和用药准确提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

MM400冷冻混合球磨仪(德国RETSCH公司)，各种量程的微量移液器(德国 Eppendorf 公司)，高速离心机(德国Sigma公司)，BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR仪(德国Biomerta公司)，Bio-Rad型电泳仪，JY-SPDT型水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)，BG-gdsAUTD520凝胶成像分析系统。

广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒(TIANGEN)，2×Taq plus per mastermix(含染料)(北京博迈德发展有限公司)，琼脂糖G-10(赛百盛公司)。

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用试剂均为分析纯。

1.2 材料

实验材料为植物块茎，总计13份，均来源于北京华邈药业有限公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为天南星药材及其常见混伪品，凭证标本保存于北京中医药大学标本馆，其余各基原物种rbcL序列均下载于GenBank核酸数据库。材料来源及样品信息见表1。

1.3 DNA提取

取样品约20 mg，经球磨仪粉碎后，根据天根广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒使用说明提取DNA，微量核酸定量仪检测所得DNA质量。

1.4 PCR扩增

采用30 μL反应体系：样品总DNA为2 μL，rbcL正反向引物(F-5′-ATGTCACCACAAACAGAAACT-3′；R-5′-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3′)各1 μL，2×Mix聚合酶15 μL，ddH2O补足。

PCR反应程序：95℃预变性3分钟，30个循环：95℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，72℃总延伸5分钟。

1.5 测序分析

扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下检验，在500 bp左右处出现单一、明亮、清晰的条带，剩余PCR产物由北京小师弟商贸有限公司进行测序分析。每个样品均采用正反双向测序，以保证测序结果的准确性。

1.6 序列比对及N-J系统聚类树建立

使用ContigExpress及DNAMAN软件对测序结果进行拼接及序列比对，MEGA 5.0软件对序列长度、变异位点、保守位点以及碱基组成进行分析，计算种间种内变异特点的最小种间距离、最大种内距离并构建N-J系统聚类树，进而评估该序列用于鉴别天南星及其混伪品的可靠性。

2 结果

本研究分析了天南星科4个属8个种共21个样本，其中除了13号样品(Sample 13)未能扩增成功外，其余样品均获得测序结果。经过序列校正，对序列进行分析。

表1 样品信息表

2.1 rbcL序列分析

对实验样品(Sample 1～13)及GenBank下载的天南星及其常见混伪品rbcL序列进行分析，其中样品编号Sample 1、Sample 6～12为天南星(A.erubescens)，样品编号Sample 2为三裂叶半夏(P.tripartite)，样品编号Sample 3～5为虎掌南星(P.pedatisecta)。样品测序结果序列拼接后显示，rbcL序列长度约为580 bp。对样品的碱基组成进行分析，不同种碱基组成如表2所示。样本中G+C含量分布为43.6%～45.3%。G+C含量菖蒲(A.calamus)与其他7种差异较大，剩余7种G+C含量的整体差异较小，表明亲缘关系可能较近，但是种间未重叠，说明种间存在明显的遗传变异。

表2 8种天南星科样本rbcL序列碱基组成(%)

2.2 遗传距离分析

使用MEGA5.0软件基于K2-P模型计算各样品种内及种间遗传距离。分析结果表明，样本中最大种内遗传距离为0.2%，种间遗传距离如表3所示。结果显示种间遗传距离变化范围为0.3%～9.2%。其中，中药天南星的正品来源天南星(A.erubescens)、异叶天南星(A.heterophyllum)、东北天南星(A.amurense)种间遗传距离相对较小，显示其亲缘关系较近；天南星属与菖蒲属种间遗传距离最大，显示其二者亲缘关系较远。

2.3 基于rbcL序列的天南星及其混伪品变异位点分析

结合测序结果，运用DNAMAN分析软件对GenBank下载序列与样品序列的rbcL序列变异位点进行比对分析，结果显示，除天南星(A.erubescens)种内存在1处变异位点外，其余种内均无变异位点，说明rbcL序列在同种内具有较高的保守性。基于rbcL序列的种间变异位点如表4所示，结果显示一共存在56处变异位点，其中菖蒲属(Acoruscalamus)变异位点最多，其次为千年健属千年健(Homalomenaocculta)，显示其亲缘关系较远，而天南星属与半夏属变异位点较少，显示其亲缘关系较近。

表3 8种天南星科样本种间遗传距离

注： 编号1为天南星，编号2为异叶天南星，编号3为东北天南星，编号4为东台南星，编号5为菖蒲，编号6为虎掌南星，编号7为三裂叶半夏，编号8为千年健。

2.4 基于rbcL序列的天南星及其混伪品N-J系统聚类树构建

测序结果经过软件处理后，使用MEGA 5.0软件基于rbcL序列对天南星及其混伪品进行系统聚类树的构建，结果如图1所示，在天南星N-J系统聚类树中发现，同种不同样本严格聚为一支，且节点处支持率极高，证明天南星rbcL序列在种内具有高度保守性。且天南星正品来源天南星(A.erubescens)、异叶天南星(A.heterophyllum)、东北天南星(A.amurense)亲缘关系较近，与其他市场常见混伪品严格区别。显示rbcL序列对正品天南星及其市场常见混伪品具有很好的鉴别能力。

3 讨论

天南星科药材种类繁多，植物分布广泛[18-19]，植株及块茎形态多有相似，难以辨别[20]，药材性状易混淆，故而导致市场上用药比较混乱。且天南星科中药多有毒[21]，毒性各有不同，因而品种不清导致的混用极可能造成用药安全隐患。本实验采集市场天南星正品及其混伪品，旨在将其明确区分。

目前关于中药材鉴定的方法多种多样，但传统性状鉴别方法具有一定的局限性，远红外、指纹图谱等方法操作复杂。而近些年来发展较快的DNA分子鉴定技术与传统鉴定相结合的方法，可大大提高药材鉴定的效率。且研究结果表明，分子鉴定技术能够有效解决中药材的真伪问题，符合中药材鉴定简单、精确的特点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。目前，已有多种基因片段被作为植物的通用条形码而广泛使用，如ITS 2、psbA-trnH、matK、rbcL等[22]。生命条形码联盟植物工作组推荐将编码rbcL和成熟酶K(Maturase K,matK)的基因作为陆生植物的DNA条形码序列[23]。Newmaster 等发现rbcL能够鉴别同属85%左右的物种，认为rbcL在植物类群中可作为DNA条形码候选序列，具有较好的鉴定效率[24]。

表4 8种天南星科样本变异位点分析

注： 编号1为天南星，编号2为异叶天南星，编号3为东北天南星，编号4为东台南星，编号5为菖蒲，编号6为虎掌南星，编号7为三裂叶半夏，编号8为千年健。

注：编号1～3为天南星，编号4～6为异叶天南星，编号7～9为东北天南星，编号10～12为东台南星，编号13～14为菖蒲，编号15～17为虎掌南星，编号18为三裂叶半夏，编号19～20为千年健。图1 天南星及其市场常见

混伪品rbcL N-J树(Bootstrap>1000)

目前，关于中药天南星的DNA分子鉴定已有报道，刘利平等[25]考察了4个DNA条形码(psbK-psbI，matK，rbcL，atpF-atpH)对天南星及其易混品的鉴定能力，结果表明atpF-atpH序列和psbK-psbI序列较为适用，rbcL的鉴定成功率仅为41.67%。

本实验中选择了较为常用的3种DNA条形码进行扩增比较，包括ITS、psbA-trnH和rbcL。由于收集的样品来自市场，样品表面难免存在真菌污染的情况，实验过程中在采取ITS通用序列扩增测序时发现因真菌污染导致扩增成功率不高，峰图杂乱，甚至测出真菌序列，鉴定效率较低。在对rbcL序列与psbA-trnH序列使用通用引物对其进行扩增时发现，psbA-trnH引物对序列进行扩增时出现扩增失败率较高的情况，故而本实验主要采用叶绿体rbcL序列对天南星及其市场常见混伪品进行鉴别研究。实验过程中发现rbcL序列具有易扩增、通用性好、Blast比对简单的特点，且其鉴别效率高，可完全将天南星正品与其常见混伪品分开。

本实验结果表明rbcL不仅可将天南星及其混伪品准确区分，且在实验条件下扩增成功率92.31%，测序成功率100%，鉴定成功率100%，效果均高于前人研究(扩增成功率88.16%，测序成功率96.88%，鉴定成功率41.67%)。通过对比前人实验，发现前人实验材料大多为天南星属植物，而本实验主要涉及多个属种之间样品的鉴别，故而推测rbcL序列对于鉴别同属不同种物种效率较低，对于不同属种之间的鉴别则表现出较高的鉴别效率。另外，前人所用实验材料为植物叶片，实验材料所选用的植株部位不同，鉴定效率可能也有所不同。

叶绿体基因组序列具有一定的保守性，且扩增叶绿体片段的引物是通用的，便于实验操作，采用叶绿体片段序列进行植物物种鉴定可避免污染(如真菌)，大大提高鉴定效率，在植物物种的分子鉴定方面具有较好的应用前景。