基于特征图谱的金银花与山银花(灰毡毛忍冬)质量表征比较研究

黄玉娟 舒一崧 孔静 李思潼 范圆圆 孙仁弟 黄广伟 高园园 刘路路 陈思玉 李文静 郭小趁 姜艳艳 石任兵

金银花为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.、红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、华南忍冬LoniceraconfusaDC.或黄褐毛忍冬LonicerafulvotomentosaHsu et S. C. Cheng的干燥花蕾或初开的花[1]。《中华人民共和国药典》2015年版记载的山银花与金银花在性味归经、功能主治与用法用量等方面皆一致，二者均具有清热解毒、疏风散热的功效，均可用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热[1]。在质量标准中，《中华人民共和国药典》2015年版以含绿原酸(酚酸类)不得少于1.5%和木犀草苷(黄酮类)不得少于0.05%作为金银花的质量控制指标，以含绿原酸不得少于2.0%及灰毡毛忍冬皂苷乙(三萜类)和川续断皂苷乙(三萜类)的总量不得少于5.0%作为山银花的质量控制指标[1]。

近年来有文献报道，金银花与山银花的指纹图谱相似度很高，二者的整体化学成分性质及构成比存在相似性[2]。可见，基于药物体系导向，发掘其药学架构化学成分组成的共性与特性为其药物质量精准评价的关键[3-6]。然而，尚未见二者药学质量表征的特性报道。因此，本研究基于特征图谱质量表征与中药质量评价模式[7-19]，采用HPLC-DAD法建立金银花和山银花特征图谱质量表征方法，并对不同批号不同产地的金银花和山银花饮片进行质量表征，对二者药学质量进行比较分析，以揭示二者药学质量表征共性与特性，为金银花与山银花药材饮片的质量评价和控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药材

15批金银花饮片、10批山银花饮片，具体信息见表1。经北京中医药大学中药鉴定系刘春生教授鉴定金银花均为为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或初开的花；山银花均为忍冬科植物灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz的干燥花蕾或初开的花。饮片标本现存于北京中医药大学中药学院中药化学系。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 绿原酸对照品(成都普菲德生物技术有限公司，批号：131201，纯度≥98%)；新绿原酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：P27A6F2713，纯度≥98%)；异绿原酸A对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y24N8Y49009，纯度≥98%)；异绿原酸B对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：P25J6F1793，纯度≥98%)；异绿原酸C对照品(方程生物科技有限公司，批号：120920，纯度≥98%)；隐绿原酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y12O8H45678，纯度≥98%)；咖啡酸对照品(方程生物科技有限公司，批号：121002，纯度≥98%)；獐芽菜苦苷对照品(武汉天植生物技术有限公司， 批号： CFN99818， 纯度≥98%)；断氧化马钱子苷对照品(武汉天植生物技术有限公司， 批号：CFS201803，纯度≥98%)；当药苷对照品(武汉天植生物技术有限公司，批号：CFS201802，纯度≥98%)；木犀草苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y05D8H49919，纯度≥98%)；灰毡毛忍冬皂苷乙对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：C07F9Q54520，纯度≥98%)；川续断皂苷乙对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：C21A6Q2577，纯度≥98%)；娃哈哈纯净水；乙腈、甲醇均为色谱纯；其余试剂均为分析纯(均购于北京化工厂)；去离子水等。

表1 金银花与山银花饮片信息表

1.2.2 仪器 e2695型高效液相色谱仪，含Empower Pro软件系统和2998型光电二极管矩阵检测器(美国沃特世公司)；SARTORIUS-BS124S型电子分析天平、BT124S型1/1万电子分析天平和BT25S型1/10万电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备)；HH-S型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；Buchi Rotavapor R-220旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；876-2A型真空干燥箱(上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司)；ZNHW型智能恒温电热套(郑州恒岩仪器有限公司)；电子计时器；蒸发皿；漏斗；玻璃棒；圆底烧瓶等。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液制备 分别精密称取新绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、绿原酸、木犀草苷、獐芽菜苦苷、当药苷、断氧化马钱子苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙对照品，以50%甲醇溶解配制成混合对照品溶液(新绿原酸0.31 mg/mL、当药苷0.48 mg/mL、异绿原酸A 5.08 mg/mL、异绿原酸B 0.30 mg/mL、异绿原酸C 0.90 mg/mL、隐绿原酸0.12 mg/mL、绿原酸4.83 mg/mL、断氧化马钱子苷2.73 mg/mL、獐芽菜苦苷2.89 mg/mL、木犀草苷0.19 mg/mL、灰毡毛忍冬皂苷乙5.42 mg/mL、川续断皂苷乙3.58 mg/mL)。0.45μm微孔滤膜过，备用。

1.3.2 供试品溶液制备 精确称取金银花和山银花样品粉末(过四号筛)0.1 g，置于具塞锥形瓶中。精密加入50%甲醇10 mL，称定重量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)60 min。放冷再称定重量，50%甲醇补足减失的重量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水(C)-乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～20 min，10%→20%A；20～20.1 min，20%→22% A；20.1～40 min，22%→30%A；40～50 min，30%→35%A；50～60 min，35%→100%A。检测波长：211 nm，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：20 μL。混合对照品溶液色谱图，见图1。

1.5 方法学考察

特征图谱方法学考察和代表性成分含量测定方法学考察表明方法良好，符合实验要求[1]。

2 结果

2.1 金银花质的表征及其关联分析

2.1.1 金银花质的表征 取J1～J15金银花饮片，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，每批平行制备3份，按“1.4”项色谱条件进样分析。根据15批金银花的HPLC色谱图建立金银花特征图谱，同时标记30个特征峰，结果见图2。

注：1新绿原酸；2獐芽菜苦苷；3当药苷；4隐绿原酸；5绿原酸；6断氧化马钱子苷；7木犀草苷；8异绿原酸B；9异绿原酸A；10异绿原C；11川续断皂苷乙；12灰毡毛忍冬皂苷乙图1 混合对照品溶液色谱图

图2 15批金银花饮片特征图谱

2.1.2 金银花质的表征关联分析 30个特征峰中共有环烯醚萜类16个、酚酸类8个、黄酮类4个、三萜皂苷类2个，各特征峰保留时间及相对保留时间见表2。通过与对照品比对，在特征峰中指认出11个代表性成分，环烯醚萜类3个、酚酸类6个、黄酮类1个、三萜皂苷类1个。其中，特征峰6为新绿原酸、特征峰7为獐芽菜苦苷、特征峰9为当药苷、特征峰10为隐绿原酸、特征峰11为绿原酸、特征峰12为断氧化马钱子苷、特征峰22为木犀草苷、特征峰26为异绿原酸B、特征峰28为异绿原酸A、特征峰29为异绿原酸C、特征峰30为灰毡毛忍冬皂苷乙。

表2 金银花特征图谱中特征峰关联化学成分类型、保留时间及相对保留时间

续表

2.2 金银花量的表征及其关联分析

2.2.1 基于代表性成分峰面积及含量的量的表征 分别精密称取J1～J15金银花样品，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，每批样品平行制备3份，按“1.4”项色谱条件进样分析，测定图谱中新绿原酸、獐芽菜苦苷、当药苷、隐绿原酸、绿原酸、断氧化马钱子苷、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C和灰毡毛忍冬皂苷乙的峰面积，加和各类代表性成分峰面积得到总环烯醚萜、总酚酸峰面积，结果见表3。计算各代表性成分含量，加和各类代表性成分含量得到总环烯醚萜、总酚酸的含量，结果见表4。

2.2.2 基于代表性成分含量表征的关联分析 通过SPSS20.0 Pearson相关性分析，对代表性成分新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、总酚酸(以新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C表征)、獐芽菜苦苷、当药苷、断氧化马钱子苷、总环烯醚萜(以獐芽菜苦苷、当药苷、断氧化马钱子苷表征)、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和总成分(以11种代表性成分含量加和表征)的含量进行相关性分析。结果显示，绿原酸和总成分的含量呈现显著正相关，绿原酸相关系数为0.584，因此可用绿原酸作为基准成分表征金银花中总成分。绿原酸和异绿原酸A与总酚酸的含量呈现显著正相关，绿原酸的相关系数为0.937，异绿原酸A的相关系数为0.571，因此可用绿原酸作为指标性成分表征金银花中酚酸类成分。獐芽菜苦苷与总环烯醚萜的含量呈现显著正相关，獐芽菜苦苷相关系数为0.778，因此可用獐芽菜苦苷作为指标性成分表征金银花的环烯醚萜类成分。代表性成分中黄酮类和三萜皂苷类成分分别为木犀草苷和灰毡毛忍冬皂苷乙，因此可用木犀草苷作为指标性成分表征金银花的黄酮类成分，灰毡毛忍冬皂苷乙作为指标性成分表征金银花的三萜皂苷类成分。

2.2.3 基于代表性成分峰面积及含量的相对比值表征的关联分析 以金银花中的代表性成分绿原酸为基准成分，以15批金银花绿原酸含量和峰面积的均值为基准值，计算各批次代表性成分的相对含量、峰面积及类型成分含量和峰面积的相对比值并作图，得图3、图4。并进行质量表征关联分析。由图3、图4可知，15批金银花类型成分相对含量的均值大小关系为：总环烯醚萜>总酚酸，其波动性为：总环烯醚萜(RSD：8.74%)>总酚酸(RSD：7.16%)。指标性成分相对含量的均值大小关系为：绿原酸>獐芽菜苦苷>灰毡毛忍冬皂苷乙>木犀草苷，其波动性为：獐芽菜苦苷(RSD：19.59%)>绿原酸(RSD：11.61%)>灰毡毛忍冬皂苷乙(RSD：9.05%)>木犀草苷(5.13倍)。代表性成分相对含量的均值大小关系为：绿原酸>断氧化马钱子苷>当药苷>獐芽菜苦苷>灰毡毛忍冬皂苷乙>异绿原酸A>异绿原酸C>新绿原酸>异绿原酸B>隐绿原酸>木犀草苷，其中，金银花特质成分当药苷相对含量、相对峰面积由高至低排序为J4、J12、J15、J14、J1、J8、J6、J9、J13、J10、J3、J11、J2、J7、J5。基于金银花代表性成分相对含量、相对峰面积进行考量，批号J4、J5、J6、J8、J9、J10较高。综合代表性成分和特质成分相对含量、相对峰面积进行考量，批号J4、J6、J8、J9较高。

2.3 山银花质的表征及其关联分析

2.3.1 山银花质的表征 取S1～S10山银花饮片，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行制备3份，按“1.4”项下色谱条件进行进样分析。根据10批山银花的HPLC色谱图，得到山银花特征图谱。结果见图5。由图5可知，其他9批山银花饮片均含有与基准饮片(S3)相同的特征峰，共30个。

表3 金银花代表性成分峰面积和含量(n=3)

注： /表示成分未检出。

图3 15批金银花代表性成分及类型成分含量相对比值

图4 15批金银花代表性成分及类型成分峰面积相对比值图

图5 10批山银花饮片特征图谱

2.3.2 山银花质的表征关联分析 30个特征峰中共有环烯醚萜类6个、酚酸类11个、黄酮类5个、三萜皂苷类8个，各特征峰保留时间及相对保留时间，结果见表4。通过与对照品比对，在特征峰中指认出11个代表性成分，环烯醚萜类3个、酚酸类6个、黄酮类1个、三萜皂苷类1个。其中，特征峰2为新绿原酸、特征峰3为獐芽菜苦苷、特征峰5为隐绿原酸、特征峰6为绿原酸、特征峰7为断氧化马钱子苷、特征峰16为木犀草苷、特征峰18为异绿原酸B、特征峰19为异绿原酸A、特征峰20为异绿原酸C、特征峰26为川续断皂苷乙、特征峰27为灰毡毛忍冬皂苷乙。

表4 山银花特征图谱中特征峰关联化学成分类型、保留时间及相对保留时间

2.4 山银花量的表征及其关联分析

2.4.1 基于代表性成分峰面积及含量的量的表征 分别精密称取S1～S10山银花样品，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，每批样品平行制备3份，按“1.4”项下色谱条件进行进样分析，测定图谱中新绿原酸、獐芽菜苦苷、隐绿原酸、绿原酸、断氧化马钱子苷、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬皂苷乙的峰面积，加和各类代表性成分峰面积得到总环烯醚萜、总酚酸和总三萜皂苷峰面积，结果见表5。

2.4.2 基于代表性成分含量表征的关联分析 通过SPSS20.0 Pearson相关性分析，对代表性成分新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、总酚酸(以新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C表征)、獐芽菜苦苷、断氧化马钱子苷、总环烯醚萜(以獐芽菜苦苷和断氧化马钱子苷表征)、川续断皂苷乙、灰毡毛忍冬皂苷乙、总三萜皂苷(以川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬皂苷乙表征)、木犀草苷和总成分(以11种代表性成分含量加和表征)的含量分别进行相关性分析。结果显示，绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和总成分的含量呈现显著正相关，相关系数分别为0.682、0.677，因此可用绿原酸作为基准成分表征山银花总成分。异绿原酸A、绿原酸与总酚酸的含量呈现显著正相关，异绿原酸A的相关系数为0.853，绿原酸的相关系数为0.631，因此可用异绿原酸A作为指标性成分来表征山银花酚酸类成分。獐芽菜苦苷和断氧化马钱子苷均与总环烯醚萜的含量呈现显著正相关，相关系数分别为0.725和0.824，因此可用断氧化马钱子苷作为指标性成分表征山银花环烯醚萜类成分。代表性成分中黄酮类成分为木犀草苷，因此可用木犀草苷作为指标性成分表征山银花黄酮类成分。灰毡毛忍冬皂苷乙与总三萜皂苷的含量呈现显著正相关，相关系数为0.965，因此可用灰毡毛忍冬皂苷乙作为指标性成分表征山银花三萜皂苷类成分。

2.4.3 基于代表性成分含量及峰面积相对比值表征的关联分析 以山银花中的代表性成分绿原酸为基准成分，以10批山银花绿原酸含量和峰面积的均值为基准值，计算各批次代表性成分的相对含量、峰面积及类型成分含量和峰面积的相对比值，并作图，结果见图6、7,进行质量表征关联分析。由结果可知，10批山银花类型成分相对含量的均值大小关系为：总酚酸>总三萜皂苷>总环烯醚萜，其波动性为：总环烯醚萜(RSD：8.08%)>总三萜皂苷(RSD：6.37%)>总酚酸(RSD：3.31%)。指标性成分相对含量的均值大小关系为：异绿原酸A>灰毡毛忍冬皂苷乙>断氧化马钱子苷>木犀草苷，其波动性为：断氧化马钱子苷(RSD：19.21%)>灰毡毛忍冬皂苷乙(RSD：11.09%)>木犀草苷(RSD：6.31%)>异绿原酸A(RSD：4.49%)。10批山银花代表性成分含量均值由高至低依次为：异绿原酸A>灰毡毛忍冬皂苷乙>绿原酸>川续断皂苷乙>獐芽菜苦苷>断氧化马钱子苷>异绿原酸C>新绿原酸>异绿原酸B>隐绿原酸>木犀草苷，其中，山银花特质成分川续断皂苷乙相对含量、相对峰面积由高至低排序为S4、S1、S2、S9、S7、S6、S8、S5、S10、S3。基于山银花代表性成分相对含量、相对峰面积进行考量，批号S4、S5、S6、S9、S10较高。综合代表性成分和特质成分相对含量、相对峰面积进行考量，批号S4、S9较高。

表5 山银花代表性成分峰面积和含量(n=3)

注：/表示成分未检出。

图6 10批山银花代表性成分及类型成分含量相对比值图

图7 10批山银花代表性成分及类型成分峰面积相对比值图

2.5 金银花与山银花的质量表征比较

2.5.1 基于共有特征峰峰面积比较 对金银花与山银花共有特征峰峰面积均值及其相对标准偏差进行分析，金银花和山银花具有15个共有峰，其中共有峰1、3、7、8、9、10为环烯醚萜类特征峰，共有峰2、5、6、12、13、14为酚酸类特征峰，共有峰4、11为黄酮类特征峰，共有峰15为三萜皂苷类特征峰。共有峰4峰面积在金银花中波动范围最大，共有峰8峰面积在山银花中波动范围最大。金银花中共有峰7、9峰面积大于山银花，山银花中共有峰1、2、3、4、5、6、8、10、1、12、13、14、15峰面积大于金银花。

2.5.2 基于代表性成分含量比较 对代表性成分的含量均值及其相对标准偏差进行分析，金银花和山银花共有10个代表性成分。当药苷为金银花特质成分，川续断皂苷乙为山银花特质成分。金银花中獐芽菜苦苷含量波动范围最大，山银花中断氧化马钱子苷波动范围最大。金银花中断氧化马钱子苷和木犀草苷的含量高于山银花，山银花中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、獐芽菜苦苷、灰毡毛忍冬皂苷乙的含量高于金银花。因此，金银花与山银花药学质量的共性为：二者特征图谱中存在15个共有特征峰，共有峰中环烯醚萜类6个、酚酸类6个、黄酮类2个、三萜皂苷类1个。其中二者共有代表性成分有10个，分别为新绿原酸、獐芽菜苦苷、隐绿原酸、绿原酸、断氧化马钱子苷、木犀草苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、灰毡毛忍冬皂苷乙，有5个共有代表性成分含量高低排序一致，即异绿原酸C>新绿原酸>异绿原酸B>隐绿原酸>木犀草苷。二者具有相同的的黄酮类和三萜皂苷类化合物的正相关代表性成分，分别为木犀草苷和灰毡毛忍冬皂苷乙。药学质量的特性为：金银花具有15个特有峰，其中环烯醚萜类10个，酚酸类2个、黄酮类2个、三萜皂苷类1个。环烯醚萜类、酚酸类化合物的正相关代表性成分分别为獐芽菜苦苷、绿原酸，当药苷为金银花特质成分。金银花中共有代表性成分含量关系为：绿原酸>断氧化马钱子苷>异绿原酸A>獐芽菜苦苷>灰毡毛忍冬皂苷乙。其代表性成分含量关系为：绿原酸>獐芽菜苦苷>灰毡毛忍冬皂苷乙>木犀草苷。山银花具有15个特有峰，其中环烯醚萜类10个，酚酸类2个、黄酮类2个、三萜皂苷类1个。环烯醚萜类、酚酸类化合物的正相关代表性成分分别为断氧化马钱子苷、异绿原酸A，川续断皂苷乙为山银花特质成分。山银花中共有代表性成分含量关系为：异绿原酸A>灰毡毛忍冬皂苷乙>绿原酸>獐芽菜苦苷>断氧化马钱子苷。代表性成分含量关系为：异绿原酸A>断氧化马钱子苷>灰毡毛忍冬皂苷乙>木犀草苷。

3 讨论

在本研究考察提取方法时分别考察提取溶剂(甲醇、乙醇、50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液)，提取方法(超声、回流)，提取倍量(8倍、10倍、12倍)，提取时间(30min、60min、90min)，以色谱峰个数和含量为指标，最终确定了金银花和山银花饮片处理方法为：50%甲醇10倍量超声提取60min制备供试品溶液。

在优选色谱条件时使用DAD检测器在190～400 nm全波长扫描光谱图，通过比较色谱峰数量、基线平稳程度、色谱峰面积、含量测定成分与相邻色谱峰的分离度等因素,确定211 nm为最佳测定波长；分别考察以乙腈作为有机相，0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%磷酸水溶液作为水相，不同组合之后得到的色谱图，以分离度和分析时间为指标，最后确定以乙腈～0.4%磷酸水溶液梯度洗脱最合适。在自然药学观的理论指导下[4-6]，本研究使用HPLC-DAD技术，对金银花与山银花药物体系之药学架构模式进行表征，建立了特征图谱质量表征关联分析方法，同时建立了对金银花和山银花中共12个代表性成分的含量测定方法。结果表明所建立的金银花和山银花特征图谱质量表征方法可准确地表征金银花与山银花的药学质量，并通过质量表征结果，分析了金银花和山银花的药学质与量的共性和特性，为金银花和山银花的质量评价与控制提供了新方法，也为二者在临床上的合理利用提供了科学依据。