雾化吸入布地奈德复合沙丁胺醇对单肺通气致兔肺损伤的预防作用及机制探讨

韩霜,何锟,张婧,张秀果,李建立,容俊芳

1 河北省人民医院，石家庄050051；2石家庄市第四医院

单肺通气时机械剪切力、吸入高浓度氧以及萎陷侧肺快速复张均可破坏血气交换屏障，使细胞膜通透性增加，激活体内的炎症信号通路，导致白细胞和各种促炎因子聚集，加重肺组织损伤。细胞外组蛋白是一种新发现的重要炎性介质，在感染、炎症及免疫反应中发挥重要的作用[1]。研究[2]表明，术前雾化吸入布地奈德可有效改善肺通气，减少单肺通气时肺炎症反应。沙丁胺醇为选择性β2受体激动剂，可激动支气管平滑肌的β2受体，扩张支气管，增加纤毛清除功能，降低血管通透性，改善肺功能[3]。但布地奈德复合沙丁胺醇雾化吸入是否能减轻肺组织炎症反应尚不明确。2012年10月～2013月10月，本研究观察了预雾化吸入布地奈德及沙丁胺醇是否对单肺通气致兔肺损伤有预防作用,并探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂、仪器 健康雄性新西兰大白兔24只，体质量2.5～3.0 kg，由河北医科大学实验动物中心提供。TNF-1α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒(加拿大YES公司)，细胞外组蛋白ELISA测定试剂盒(德国 Roche 公司)，硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液(深圳大佛药业有限公司)，布地奈德混悬液(阿斯利康制药有限公司，英国)。HX-200动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 布地奈德复合沙丁胺醇预雾化吸入方法及单肺通气肺损伤兔模型的建立 采用随机数字表法，将兔随机分为A、B、C组，各8只。3%的戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉后，行右侧股动脉和左侧股静脉插管术。局部浸润麻醉下行气管切开，A组采用单腔气管导管(ID 3.0 mm)置入气管行双肺通气3 h。B、C组参照文献[4,5]制备单肺通气肺损伤模型，即采用自制双腔气管导管行左侧单肺通气2 h、双肺通气1 h。C组于单肺通气前吸入沙丁胺醇0.15 mg/kg+布地奈德0.5 mg+生理盐水共2 mL。A、B组均吸入等量生理盐水。各组均采用容量通气模式，通气参数：VT 12 mL/K，FiO2100%，通气频率40次/min，I∶E为1∶2。

各组通气结束后取右侧肺下叶约1 cm×1 cm×2 cm肺组织，一部分用液氮冻存24 h后转-80 ℃保存待测，另一部分用4 ℃多聚甲醛中固定肺组织常规石蜡包埋切片。取右侧肺下叶行支气管肺泡灌洗，生理盐水5 mL,灌洗3次。支气管肺泡灌洗液经单层纱布过滤静置10 min 后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清-80 ℃冻存。

1.3 肺组织病理形态学观察 采用HE染色，400倍光镜下观察肺组织病理学结果并行肺损伤程度评分。按照肺间质水肿、肺泡水肿、中性粒细胞浸润和肺泡内充血评分：无改变或非常轻微为0分，轻度改变为1分，中度改变为2分，重度改变为3分，极重度改变为4分，累计4项指标的总分。每张切片随机选择10个高倍视野，进行10次评分，取平均值作为肺损伤评分。

1.4 肺湿/干质量(W/D)及肺通透指数(LPI)测算 取右侧肺上叶称湿质量(W)，置于80 ℃烘箱内干燥72 h至恒重，称肺干质量(D)，计算肺W/D。LPI：取右肺下叶做肺泡灌洗，用5 mL生理盐水分3 次进行灌洗，灌洗液回收量在80%以上，离心，留取上清液。取静脉血标本离心留取血浆。采用ELISA法检测灌洗液和血浆总蛋白(TP)。LPI=灌洗液TP/血清TP。

1.5 支气管肺泡灌洗液TNF-1α、IL-6、IL-1β的测定 采用ELISA法按照试剂盒说明书步骤测定支气管肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-6及IL-1β。

1.6 血浆细胞外组蛋白测定 于雾化吸入前(T1)、通气1 h(T2)、通气2 h(T3)、通气3 h(T4)采集静脉血，分离血浆，采用 ELISA 法测定血浆细胞外组蛋白。

2 结果

2.1 三组肺组织肺损伤评分、W/D、LPI比较 与A组比较，B、C组肺损伤评分、W/D、LPI高(P<0．05);与B组比较，C组肺损伤评分、W/D及LPI低(P均<0．05),见表1。

表1 三组兔肺组织肺损伤评分

2.2 三组兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6浓度比较 与A组比较，B、C组兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6浓度升高 (P均<0．05)；与B组比较，C组兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、IL-6浓度下降 (P均<0．05)，见表2。

表2 各组兔肺泡灌洗液TNFα、IL-1β、

2.3 三组各时点血浆细胞外组蛋白水平比较 与A组比较，B、C组各时间点血浆细胞外组蛋白水平升高(P均<0．05);与B组比较，C组各时间点血浆细胞外组蛋白水平降低(P均<0．05)，见表3。

表3 三组各时点血浆细胞外组蛋白水平

3 讨论

单肺通气期间细胞因子的相互激活和级联反应是引起急性肺损伤的主要机制之一。与肺部炎症有关的炎症因子为 TNFα、IL-1β，IL-6、IL-8 及细胞黏附分子，且受NF-κB的调控。TNFα 是介导急性肺损伤的主要细胞因子，可诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏。故本研究测定肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6的浓度判定肺组织炎性反应程度。雾化吸入利用高速氧气流形成液体雾，然后由呼吸道吸入以达到治疗目的，具有用量少，起效快，不良反应少等优点，能有效治疗呼吸道感染等疾病，因此本研究采用术前雾化吸入沙丁胺醇及布地奈德的给药方式。本研究结果表明，与对照组相比其余各组肺损伤评分升高，肺组织W/D及LPI升高，且肺泡灌洗液中TNF-1α、IL-1β及IL-6浓度升高，提示长时间单肺通气可导致肺组织水肿、通透性增加、炎症反应，提示单肺通气致兔肺损伤模型制备成功。

沙丁胺醇是一种短效 β2肾上腺素能受体激动剂，与气道平滑肌细胞膜上的 β-受体具有良好的亲和力，经气道雾化吸入后形成直径很小的气溶胶颗粒，可达下呼吸道，药物迅速弥散，直接作用于支气管平滑肌，使平滑肌舒张，产生强大的支气管扩张作用，从而改善肺功能，减轻肺组织缺氧性损伤，进而减轻缺氧引起的炎症反应[6]。研究[7]表明沙丁胺醇可减轻脓毒症大鼠的肺炎症反应，改善肺功能。此外,沙丁胺醇还可以促进黏膜纤毛摆动，增加纤毛清除功能，降低血管通透性，抑制炎症渗出，改善肺功能。布地奈德是一种高效的局部抗炎糖皮质激素，具有抗过敏、抗炎效果，其药理作用是稳定内皮细胞和平滑肌细胞，抑制组胺释放及支气管收缩物质的释放，缓解平滑肌的收缩。布地奈德气管内治疗可减轻盐水灌洗模型导致的急性肺损伤，减轻炎症反应，抑制肺上皮细胞凋亡，改善肺功能[8]。研究[9]表明，术前雾化吸入布地奈德可抑制开胸手术患者单肺通气时的炎性反应，有助于改善肺功能。本研究结果表明，与B组相比，C组兔肺泡灌洗液TNF-1α、IL-1及IL-6的浓度下降，肺组织W/D及LPI下降，提示单肺通气前吸入沙丁胺醇和布地奈德可减少TNF-1α、IL-1及IL-6等炎症因子的释放，从而减轻单肺通气所致的肺组织炎症反应，减轻肺组织水肿。

组蛋白是一组高度保守、碱性、带正电荷的蛋白质。当细胞受到损伤或坏死时，染色质发生降解，释放核小体入外周血，核小体再分解为组蛋白和DNA，少量组蛋白可迅速被单核巨噬细胞清除。但在严重损伤情况下，死亡细胞释放大量组蛋白，超过了机体的清除能力，过剩的细胞外组蛋白便会作为内源性损伤相关分子启动炎症反应导致进一步的损伤[10，11]。研究[12]表明，细胞外组蛋白是急性肺损伤的重要效应因子。研究[13，14]发现，小鼠在创伤、注射脂多糖后，血浆中细胞外组蛋白水平明显升高，提示细胞外组蛋白可能是ARDS病程发展的重要炎症介质，由细胞外组蛋白引起的肺内皮激活可导致ARDS患者的中性粒细胞活化。研究[15]表明，细胞外组蛋白可促进尘肺患者肺纤维化。本研究结果表明，与对照组相比，其余各组各时间点血浆细胞外组蛋白表达升高，提示细胞外组蛋白参与了单肺通气兔肺组织炎症反应。有研究[16]表明，针对循环中组蛋白的治疗可改善严重创伤后急性肺损伤患者的生存率。近期研究[17]表明，骨桥蛋白可减轻组蛋白引起的肺组织炎症反应，且肝素可减少ARDS患者中细胞外组蛋白的释放，因此通过抑制细胞外组蛋白的释放可减轻其诱发的肺炎症反应[18,19]。本研究结果显示，与B组相比，C组各时间点血浆细胞外组蛋白水平下降，提示单肺通气前吸入沙丁胺醇和布地奈德可通过降低血浆细胞外组蛋白水平而抑制肺组织炎症反应，减轻肺组织损伤程度。

综上所述，预雾化吸入布地奈德复合沙丁胺醇对单肺通气致兔肺损伤有预防作用，且可能是通过降低支气管肺泡炎性因子及血浆细胞外组蛋白水平而起作用的，至于细胞外组蛋白降低是否与布地奈德复合沙丁胺醇对单肺通气致兔肺损伤预防作用的机制有关有待进一步研究探讨。