改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值

张静 陈曦 王彬 付雷 陆宇 陈效友

结核病是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，2019年WHO[1]报告估算2018年全球约1000万例新发结核病患者，全球平均结核病发病率为130/10万，因结核病而死亡患者约为145.1万例，耐多药结核病(MDR-TB)的治愈率约为56%。面对严重的结核病疫情，亟需发现新的有效抗结核药物。体外抗结核药物活性测定是新药药效学评价的重要环节，传统平板计数法[2]，耗时长，现已较少应用；而目前国内外常用快速检测最低抑菌浓度(MIC)的方法包括微孔板Alarmar blue(MABA)法[3]、刃天青微孔板稀释(REMA)法和四唑染料 (tetrazolium dye)法等；因结核分枝杆菌生长缓慢，上述检测方法需要7～9 d才能获得结果。因此，需要建立一种快速、有效的药物活性检测方法，以满足抗结核新药开发的需要。

单叠氮乙醚(ethidium monoazide, EMA)或单叠氮丙啶(propidium monoazide, PMA；本研究使用PMA改良类似物PMAxx)[4]是一种核酸染料，它可以通过受损的细胞膜，在暴露于强可见光后共价插入细菌基因组，形成不可逆结合而干扰DNA扩增；利用EMA/PMA对受损与未受损的细菌进行预处理并联合荧光定量PCR(qPCR)检测，根据被降低或完全抑制的PCR信号来有效鉴别活菌和死菌。尽管PMA特异性渗透及抑制DNA扩增的机制尚不明确，但该方法已广泛应用于检测食品或复杂环境条件下的活菌[4]、寄生虫[5]，以及相关的水质鉴定[6]。但是，该方法针对结核分枝杆菌的研究相对较少，尚未见到直接应用于抗结核药物活性检测的报道。

本研究首先通过未经处理和热灭活的结核分枝杆菌来建立PMAxx-qPCR的检测方法，并将该方法直接应用于一线抗结核药物异烟肼(INH)和利福平(RFP)体外活性测定，并且与传统检测方法相比较，以有效评估PMAxx-qPCR方法的适用性。……