新疆戈宝麻叶中芦丁的优化提取工艺

张孟丽，张卫明，束成杰*

(1. 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023；2. 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211100)

戈宝麻(ApocynumvenetumL.)属夹竹桃科植物，根据古药典记载，其主要成分是黄酮类化合物，具有消炎止咳、强心利尿、降血压、降血脂、增强免疫、抗衰老的作用[1]。芦丁作为黄酮类化合物中的一类，具有清除自由基、促进成骨细胞的生长、降低血糖、抑制结肠癌和前列腺癌等作用[2-6]。因此本研究通过响应面法优化叶中芦丁提取工艺，为今后戈宝麻叶片药材评价提供进一步的参考。

响应面法(Response surface methodology)可以通过二次拟合出多个因素与响应值的函数关系，使之得出一个回归方程来探求最优的提取条件，是一种优化得出最合理条件的统计方法[7-8]。该方法大量用于优化植物黄酮类物质及多糖含量方面的研究，例如：Li等通过响应面及高效液相层析对槐花中芦丁含量进行优化[9]，Erkan等通过响应面方法优化葡萄提取物的抗氧化活性[10]。中心组合设计实验Box-Benhnken可进行3～7个因素范围内的实验，在因素相同时比中心复合设计所需试验次数少，可以评估因素的非线性影响，适用于所有因素均为计量值的试验，使用时无需多次重复[11]。

本研究依据响应面法中心组合设计试验Box-Benhnken，根据单因素试验结果对乙醇回流提取芦丁工艺进行优化，确定最优提取工艺，对戈宝麻的药理学应用提供进一步的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

戈宝麻(产地新疆阿勒泰)由南京野生植物综合利用研究院提供；NH-4数显恒温水浴锅(金坛市三坛仪器厂)；SHZ-DⅢ循环水式真空泵(巩义市予华仪器责任有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；KF-1209电子天平(凯丰集团有限公司)；BCD-183A冰箱(合肥荣事达电冰箱有限公司)；液相色谱仪1200系列(美国Agilent公司)；微孔滤膜(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 试剂

芦丁标准品(纯度≥98%)(上海源叶生物科技有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher Scientific公司)；磷酸、乙醇为分析纯(南京化学试剂有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁提取及测定

本试验用乙醇作为提取剂，采用回流提取法提取芦丁。将戈宝麻叶除杂干燥，粉碎，称取粉末50 g，乙醇回流提取，合并提取液，离心后过滤，放至室温，减压回收溶剂，收集滤液，微膜过滤，得样品液。

(1)色谱条件：流动相：乙腈：0.25%磷酸，流速1.0 mL/min，检测波长为360 nm[12]。

(2)标准曲线：准确称取芦丁对照品10.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得芦丁母液，置4℃冰箱避光保存备用[13]；将母液稀释成20、40、60、80、100 μg/mL，分别精密吸取20 μL进样，得线性关系良好的回归方程。

(3) 样品测定：精密吸取上述样品液20 μL进样，用标准曲线计算其芦丁含量。

1.3.2 单因素试验

(1)乙醇浓度 精密称取戈宝麻叶粉末50 g，共5份，分别加入8倍的体积分数为50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在80℃下回流提取3次，每次1 h，按 1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件测定芦丁得率。

(2)提取温度 精密称取戈宝麻叶粉末50 g，共5份，加入8倍的体积分数为70%的乙醇，分别在50、60、70、80、90℃下回流提取3次，每次1 h，按1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件测定芦丁得率。

(3)提取时间 精密称取戈宝麻叶粉末50 g，共4份，加入15倍的体积分数为70%乙醇在80℃条件下回流提取3次，分别提取1、2、3 h，按 1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件测定芦丁得率。

(4)提取次数 精密称取戈宝麻叶粉末50 g，共4份，加入15倍的体积分数为70%乙醇，在80℃条件下回流提取1 h，分别提取1、2、3次，按 1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件测定芦丁得率。

(5)物料比 精密称取戈宝麻叶粉末50 g，共3份，加入6、8、10、12、15倍的体积分数为70%乙醇，在80℃条件下回流提取3次，每次1 h，按 1.3.1项下方法制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件测定芦丁得率。

1.4 响应面法优化试验设计

通过响应面法，依据Box-Benhnken-Design方法原理，联系单因素的试验结果，以芦丁得率为响应值(Y)，建立回归曲线方程。采用 Design-Expert 10 软件来对数据进行处理与回归分析，选出最佳提取工艺。响应面试验因素水平表见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.5 数据处理

所有数据均为平均值±平均标准误差(S.E.M)。数据分析使用SPSS 12.0软件完成(SPSS Inc., Chicage, USA)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

高效液相层析已经广泛应用于天然植物有效成分的定量和定向分析。如图1所示，为芦丁标准品和戈宝麻叶样品溶液高校液相色谱图；如图2为芦丁标准曲线，计算得知，芦丁的峰面积与质量浓度呈线性关系，回归方程为y=27.011x-10.74，r=0.9936(y为峰面积，x为质量浓度，r为相关因数)；结果表明，当芦丁进样浓度在0.01～0.1 mg/mL的范围时，线性关系良好。

图1 芦丁标准品及样品溶液高效液相色谱图

图2 芦丁标准曲线

2.2 精密度试验

取某一供试品溶液，精密吸取20 μL，按“1.3.1”色谱条件分别连续进样6次，测定供试品溶液中芦丁的峰面积，计算金丝桃苷及芦丁含量的RSD值，以评价仪器的精密度[14-20]。测得叶中芦丁含量的RSD值为2.8%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验

取某一供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10 h进样20μL，测定供试品溶液中芦丁的峰面积，计算芦丁含量的RSD值，以评价供试品溶液的稳定性[14-20]。叶中芦丁含量的RSD值为2.5% (n=6)，表明各供试品溶液在配制24 h内稳定。

2.4 重复性试验

如表8，取某一供试品溶液3份，并进行HPLC测定，记录峰面积计算芦丁含量的RSD值，以评价方法的重现性[14-20]。叶中芦丁含量的RSD值分别为2.3% (n=3)，表明该方法的重复性满足要求。

2.5 回收率试验

如表2，取戈宝麻叶样品液1 mL，加入对照品，制备供试品溶液，并在相同色谱条件下进样20 μL，测定峰面积，计算平均加样回收率及RSD值[14-20]。测得叶中芦丁平均加样回收率为 96.9%；RSD为 2.6% (n=6)；

表2 叶中芦丁加样回收试验结果

2.6 单因素试验结果

2.6.1 乙醇浓度对芦丁提取率的影响

如图3，在乙醇浓度为50%之前，随乙醇浓度增加，芦丁提取率不断增加，在50%时提取率达到一个峰值，浓度为50%～60%时，芦丁提取率缓慢下降，之后60%～80% 时芦丁提取率又升高，浓度为80%时提取率又达到另一峰值，80%后提取率又下降，而乙醇浓度为80%时芦丁提取率最高，因此选择乙醇浓度为80%。

图3 乙醇浓度对芦丁得率的影响

2.6.2 提取温度对芦丁提取率的影响

如图4，在70℃之前，随温度升高，芦丁提取率不断增加，在70℃时提取率达到最大峰值，从70℃到90℃提取率缓慢下降后稍有回升，原因可能是温度过低时芦丁不能得到充分提取，温度过高则可能导致芦丁降解。因此选择提取温度为70℃。

图4 提取温度对芦丁得率的影响

2.6.3 提取时间对芦丁提取率的影响

如图5，随着提取时间增加，戈宝麻叶中芦丁提取率呈现先增加后降低的趋势，在 2 h 时最大。因此，确定最优的提取时间为2 h。

2.6.4 提取次数对芦丁提取率的影响

如图6，随着提取次数增加，戈宝麻叶中芦丁提取率呈现先增加后降低的趋势，在提取2次时得率最高，原因可能是提取2次时芦丁已得到充分提取，在提取第3次时芦丁成分部分分解导致得率下降。因此，确定最优的提取次数为2次。

图5 提取时间对芦丁得率的影响

图6 提取次数对芦丁得率的影响

2.6.5 物料比对芦丁提取率的影响

如图7，在物料比在1∶4～1∶10之间时，可能是因为芦丁未能充分溶解于乙醇中，导致提取含量变化不大；随着乙醇量增加，溶解在乙醇里的多糖也随之增加，因此物料比在1∶10～1∶15时，芦丁提取率也在增加，但在1∶12时，多糖得率达到最大峰值，从而确定最优物料比为1∶12。

2.7 响应面实验结果及分析

2.7.1 响应面法设计及结果

以戈宝麻芦丁得率为响应值Y，以提取时间A，提取温度B，提取次数C，物料比D，乙醇浓度D 为自变量进行响应面法分析试验，试验方案和结果见表3。

2.7.2 多元二次响应面回归模型的建立和方差分析

响应面法比传统的单参数方法更加优化，而且节省时间和材料。表3结果利用响应面法进行多元回归拟合分析，软件得出一个回归方程为：R=+0.56-0.005179A+0.024B+0.10C+0.030D-0.041E+0.034AB+0.036AC×0.016AD-0.023AE-0.074BC-0.0592BD-0.00938BE-0.012CD+0.036CE+0.006572DE-0.062A2+0.007711B2-0.044C2-0.013D2-0.035E2，决定系数是R2=0.9488。

图7 物料比对芦丁得率的影响

模型的“Pr > F” = 0.0013 < 0.01，所以该模型是高度显著的。失拟项“Pr > F” < 0.0001，说明选取这个模型是合理的，可以通过此模型来预测戈宝麻芦丁最优提取条件，见表4。回归方程中 C、A2对戈宝麻芦丁得率影响高度显著，E、BC对多糖得率影响是显著，说明温度、时间、次数、乙醇浓度对芦丁得率影响明显，并且各因素之间有相互作用的关系，同时说明各因素条件之间对于响应值的影响并不是简单的线性关系。研究方程的变量系数值可看出，各个影响因素对多糖得率影响大小的关系是提取次数 > 乙醇浓度 > 物料比 > 提取温度 > 提取时间。

表3 Box-Behnken-Design 试验设计及结果

续表3 Box-Behnken-Design 试验设计及结果

表4 试验结果方差分析表

2.8 响应面法分析因素间的相互作用

根据回归方程，固定其它3个因素在零水平上，研究另外2个因素间的交互效应，作响应曲面图，分析各影响因素对多糖提取率的影响以及各因素间的交互效应；响应面影响因素提取时间(A)和提取次数(C) 、提取次数(C) 和乙醇浓度(E) 、物料比(D) 和乙醇浓度(E) 、提取时间(A)和乙醇浓度(E)、提取时间(A)和物料比(D)、提取时间A和提取温度B、提取次数C和提取温度(B)、提取温度(B)和乙醇浓度(E)、提取温度(B)和物料比(D)、提取次数(C)和物料比(D)的交互作用的响应面和等高线分别如图8～17 所示。响应面坡度相对平缓表示两因素交互作用不显著，坡度相对较陡表示两因素交互作用显著; 等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，等高线越密集，说明二者交互作用越显著，等高线越疏则相反，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则相反[11]。

图8 提取次数和提取时间对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图9 提取次数和乙醇浓度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

如图8-17，3-D响应面和等高线图显示出在固定3个因素零水平条件下其它两个因素对罗布麻叶片芦丁得率的影响。其中提取温度和提取次数交互作用对多糖得率影响比较显著，其它每两个因素交互作用不显著，表现为曲面较为平缓。如图8，芦丁得率随提取次数增加而逐渐增大，随提取时间增加芦丁含量先上升后下降，芦丁得率的变化随着提取时间的变化大于提取次数的变化，说明在提取时间和提取次数两个因素中受提取时间的影响较大。如图9，芦丁得率的变化随着乙醇浓度的变化未发生明显变化，芦丁得率随提取次数增加而逐渐增大，其中提取次数对芦丁得率影响较大。如图10，乙醇浓度和物料比变化对芦丁得率都影响不显著，但是乙醇浓度对芦丁得率影响比物料比显著。如图11，乙醇浓度变化对芦丁得率影响不显著，随提取时间增加芦丁含量先上升后下降，其中提取时间对芦丁得率影响大于乙醇浓度对芦丁得率影响。如图12，表现芦丁得率随提取时间增加芦丁含量先上升后下降，物料比对芦丁得率没有显著影响。如图13，提取温度对芦丁得率没有显著影响，其中提取时间对芦丁得率影响大于提取温度对芦丁得率影响。如图14，提取温度和提取次数交互作用对芦丁得率影响比较显著，芦丁得率随提取次数和提取温度的同时增加而逐渐增大，其中提取次数对芦丁得率的影响大于提取温度。如图15，乙醇浓度和提取温度的交互作用不显著，乙醇浓度对芦丁得率影响较大。如图16，提取温度和物料比对芦丁得率没有显著作用。如图17，提取次数对芦丁得率影响比物料比更显著。综合3-D响应面和等高线图得出，提取时间、提取次数、物料比对芦丁得率影响具有显著性。

图10 物料比和乙醇浓度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图11 提取时间和乙醇浓度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图12 提取时间和物料比对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图13 提取时间和提取温度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图14 提取次数和提取温度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图15 提取温度和乙醇浓度对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图16 提取温度和物料比对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

图17 提取次数和物料比对芦丁得率交互作用影响的响应面和等高线图

2.9 验证试验

根据响应面法软件进行参数的最优化分析，得出提取率的优化条件为提取温度 72.21℃、提取时间2.080 h、料液比1∶14.866 (g ∶mL)、提取3次、提取温度60℃、乙醇浓度86.189%。在此工艺条件下，戈宝麻中芦丁理论得率为0.685%。为了验证该法的可靠性以及可行性，用最佳条件进行试验。

考虑到实际操作的可行性与简便性，将芦丁的提取条件修正为提取温度60℃、提取时间2h、料液比1∶15 (g ∶mL)、提取3次、乙醇浓度86%，结果得出戈宝麻中芦丁得率的实际值为 0.677%，与理论值非常接近；通过响应面法设计试验，芦丁提取率得到很大提高。因此，利用响应面分析法得到的戈宝麻提取条件真实可靠，具有实用价值。

3 讨论

目前正交实验被广泛应用于各种药用成分的提取，但是正交实验在实际生活应用中存在诸多局限性，响应面试验设计法是用一个多元二次回归方程，拟合试验中多个因子与响应值间的关系，通过计算得极值则能达到优化目的[21-22]。

本研究在单因素试验基础上，采用响应面法对戈宝麻中芦丁的提取工艺进行优化。结果显示，戈宝麻叶中芦丁的最优提取条件是提取温度60℃、提取时间2.080 h、提取3次，料液比1∶14.866 (g:mL)，乙醇浓度80%，理论最佳芦丁得率为0.685%，实际芦丁得率为0.677%。本研究说明通过响应面法优化叶中芦丁提取工艺可行性很高，并且具有实际使用的价值，减少了药用活性成分提取的盲目性，为戈宝麻中抗氧化物质进一步开发利用提供了理论指导，为新疆阿勒泰地区戈宝麻资源利用及加工奠定基础。