苦瓜花粉钴辐照效应及授粉后对其后代表型性状的影响

陈小凤，黄如葵，梁家作，黄玉辉，冯诚诚，黄熊娟，刘杏连，秦 健，琚茜茜

(1.广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007；2.广西蔬菜育种与新技术研究重点实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】苦瓜(MomordicacharantiaL.)起源于东南亚的热带地区，广泛分布于热带、亚热带及温带地区，资源类型丰富。以往我国作物种质资源研究的重点多在收集、保存与鉴定等方面，对高产、优质、多抗、高效等关键功能基因的发掘与利用滞后，造成特有基因资源流失严重[1]，而苦瓜特有基因资源的流失会使苦瓜遗传基因基础变窄。辐照诱变是创制新种质的有效途径之一，已在蔬菜中成功选育出优良品种或优良育种材料[2-3]。花粉包含植物的性细胞，具有旺盛的分裂能力和对60Co-γ射线敏感的优点[4]。因此，分析苦瓜花粉的辐照效应及授粉后对其后代表型性状的影响，对创制苦瓜新种质以拓宽苦瓜基因来源具有重要意义。【前人的研究进展】种子、植株和花粉均可作为辐照材料，但对辐照的敏感性不同，其中最敏感的是具有旺盛分裂能力的分生组织和性细胞，而处于休眠状态的干种子具有很大的辐照抗性，但由于易获取，方便辐照操作，因此仍是辐照育种中利用最普遍的辐照材料，其相应的辐照效应研究也最多[4]。黄如葵等[5]用60Co-γ射线照射苦瓜干种子，发现以辐照剂量600～700 Gy处理苦瓜干种子的发芽率、出苗率和成苗率较佳，并认为成苗率是确定辐照剂量可靠而敏感的测定指标；采用分子标记结合田间筛选培育获得苦瓜纯雌单株116株，雌花率≥50 %的强雌性单株162株，辐照效果明显。已有研究表明，利用分裂旺盛的愈伤组织为辐照材料创制新种质可获得较佳的效果[6]，但苦瓜的组织培养技术尚未完全成熟，愈伤组织难以分化不定芽[7-8]，无法进行分裂旺盛组织辐照以创制新种质。在葫芦科蔬菜中，辐照花粉授粉的目的多为获得单倍体，不是进行辐照后代性状选择[9-11]。【本研究切入点】花粉是有花植物的雄性生殖细胞，携带有植物体一半的染色体，辐照可能使花粉携带的染色体产生变异，并通过授粉授精而发育成突变的种子，进而通过选择变异后代来创制新种质，但目前以60Co-γ射线进行苦瓜花粉辐照处理的研究未见报道。【拟解决的关键问题】利用不同剂量60Co-γ射线进行苦瓜花粉辐照，从花粉萌发率和辐照1代(M1)单瓜种子数等方面分析其辐照效应，并观测和记录田间种植辐照花粉授粉辐照1～5代(M1～M5)的表型性状，探讨苦瓜花粉辐照效应与其后代表型变异间的关系，为创制苦瓜新种质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为苦瓜高代自交系MC6、MC9和MC143，由广西农业科学院蔬菜研究所提供，按照《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 苦瓜》(NY/T2354-2013)中有关苦瓜性状描述，可将其辐照前的基本性状列于表1。

1.2 花粉辐照方法及花粉萌发率测定

花粉辐照处理于2014年9月在广西南宁市广西农业科学院示范基地进行。在15：00左右采集各苦瓜材料将于次日开放的雄花，装入防水袋中，立即带至广西辐照中心进行60Co-γ射线辐照，辐照剂量设100、150、200、250、300和350 Gy处理，以未辐照雄花的苦瓜材料为对照(0 Gy)。将辐照过的雄花保存在25 ℃、相对湿度43 %条件下，次日早上待花药散粉后，将混合花粉均匀涂入含10 %蔗糖、0.02 %硼酸和0.8 %琼脂的培养基中，将培养皿置于25 ℃的黑暗条件下进行花粉萌发试验，以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准,3次重复。每个培养皿任取10个视野统计萌发率[12]。

花粉萌发率(%)=萌发的花粉粒数/该视野总花粉粒数×100

表1 供试苦瓜材料辐射前的基本性状

1.3 辐照花粉的授粉

在取雄花的当天下午，将要受粉的雌花套袋，次日早上用辐照过的雄花授粉并作好标记，继续套袋隔离至座果。同一材料的雄花授同一材料的雌花，每个辐照处理均授粉23朵雌花。待果实自然成熟后，统计成熟种子数，取平均数为最终的单瓜种子数。

1.4 苦瓜表型性状观测及记录

2015年8月至2018年8月在广西农业科学院里建科研基地进行田间观测记录。田间种植150、200和250 Gy60Co-γ辐照花粉处理的M1种子。因枯萎病发病严重，150和250 Gy辐照花粉处理的植株死亡，未获得种子，而200 Gy辐照花粉处理的植株成活并获得种子。因此，本研究田间种植辐照剂量为200 Gy花粉授粉的后代，并将其M2产生表型性状变异的植株连续种植至M5，进行单株自交授粉，单瓜采收，按《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 苦瓜》中的方法进行相关性状观测和记录，具体为田间随机种植变异株后代20株，果皮色、果实形状、瘤状突起大小、瘤状突起顶形状、棱长、果实横径和单果重量等性状指标为取主蔓上第2个生长正常的商品瓜进行观测，本研究仅统计出现变异的指标；以30 %植株开始采收第一个商品瓜为采收始期，按标准品种进行分级，对照为辐照前材料。

变异率(%)=变异株数∕成活株数×100

1.5 统计分析

采用Excel 2007对试验数据进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ辐照剂量对苦瓜花粉萌发率和授粉后M1单瓜种子数的影响

图1显示，3个苦瓜材料的花粉萌发率均随着60Co-γ射线辐照剂量的增加而下降，至辐照剂量为350 Gy时，MC6、MC9和MC143的花粉萌发率分别由对照的89.3 %、92.8 %、95.5 %分别降至0.8 %、0.3 %和0.4 %(图1-A)；所有辐照剂量处理的花粉均能刺激果实膨大，且高剂量和低剂量处理均出现正常发育和发育迟缓的果实，但单瓜平均种子数随着辐照剂量的增加而减少(图1-B)，至辐照剂量在300 Gy以上时，果实中的种子没有发育成熟的胚，只有种壳，说明利用辐照花粉授粉的方法进行苦瓜新种质创制时，花粉的辐照剂量不宜高于300 Gy。

2.2 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代表型性状的影响

2.2.1 对性型的影响60Co-γ辐照花粉授粉后，MC6的M2出现强雄变异株，连续种植3代后，仍表现较强雄性状，至M5后获得该性状的稳定后代(图2-A)，变异率为0.88 %(表2)。MC9的M2出现了全雌性状植株(图2-B)，利用300 mg/L AgNO3对全雌变异株进行诱雄处理[13]，结果表现出3种情形，一是出现两性花(图2-C)，二是同时出现两性花和正常的雄花(图2-D)，三是全部表现为正常雌花，至M5时，第1和第3种情况的植株依然表现全雌性状，第3种情况诱雄后未出现两性花是由于诱雄不成功导致；第2种情况在M3有全雌和强雌的分离现象，再种植后全雌性状稳定至M5，全雌性状的总变异率仅为1.97 %(表2)，说明全雌性状能稳定遗传给后代。MC143的M2未出现性型变异的单株(表2)。

2.2.2 对后代果实皮色的影响 表3显示，60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，MC6的M2单株出现果实皮色为绿白的变异(图3-B)，变异率为2.63 %，但M3单株后果实皮色由绿白变回对照(图3-A)的浅绿白色(图3-C)，不能稳定遗传给后代，变异率降为0；MC9的M2单株出现果实皮色由其对照(图3-D)的绿色变为浅绿色的变异(图3-E)，且该性状稳定至M5，变异率为0.66 %；MC143的M2单株未出现果实皮色变异。说明60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉能引起部分基因型苦瓜后代果实皮色发生变异，有些变异能稳定地遗传给后代，有些变异可能不是由基因变异引起，不能稳定遗传给后代。

图1 不同辐照剂量对苦瓜花粉萌发率及授粉后对其M1单瓜种子数的影响Fig.1 Effects of different irradiation dosages on the germination rate of bitter gourd pollen and single-fruit seed number in M1 plants

表2 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代性型的影响

注：-表示未变异，下同。

Note:- represented no variation，the same as below.

表3 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代果实皮色的影响

A：MC6强雄变异株的枝条；B：MC9全雌变异株的枝条；C：MC9两性花(箭头所指为成熟雄蕊)；D：MC9同时出现两性花和正常雄花的枝条(箭头所指为未开放的两性花和雄花)A：A branch of the muant，MC6，with strong male tendency；B：A branch of the gynoecious mutant，MC9；C：Monoecious flowers of MC9(Arrow refers to mature stamen)；D：A branch with both monoecious and male flowers(Arrow refers to an unopened monoecious flower and a male flower，respectively)图2 2个苦瓜材料后代的性型变异代表Fig.2 Representative photos of sexual variation in the two tested bitter gourds

A：MC6的对照浅绿白色果实；B：MC6的M2变异株的绿白色果实；C：MC6变异株绿白色果实恢复为浅绿白色果实；D：MC9的对照绿色果实；E：MC9的M2变异株的浅绿色果实A：Pale green-white fruit of the wild type MC6；B：Variation on green-white fruit in M2 plants of MC6；C：Green-white fruit return to pale green-white fruit on MC6 plants；D：Green fruit of wild type MC9；E：Pale green fruit in M2 plants of MC9图3 2个苦瓜材料后代果实皮色的变异代表Fig.3 Representative photos of fruit color variation in the two tested bitter gourds

表4 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代果实长度的影响

表5 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代果实形状的影响

2.2.3 对后代果实长度的影响 表4显示，60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，MC9的M2单株出现果实长度变短～中(15～20 cm)的变异(图4-B)，变异率为3.29 %，但至M3单株后果实长度由短～中变回辐照前的短(图4-A)，不能稳定遗传给后代，变异率降为0；MC6和MC143的M2单株未出现果实长度变异。说明60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，其后代果实长度未发生稳定变异。

2.2.4 对后代果实形状的影响 表5显示，60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，MC143的M2单株出现果实形状为卵形(图4-D)和近球形(图4-E)的变异，变异率为5.26 %，但至M3单株后果实形状变回辐照前的纺锤形(图4-C)，不能稳定遗传给后代，变异率降为0；MC6和MC9的M2单株未出现果实形状变异。说明60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，其后代果实形状未发生稳定变异。

2.2.5 对后代收获始期的影响 表6显示，60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉后，MC6的M2单株出现收获始期为中和晚的变异，变异率为1.77 %，其中收获始期为中的变异株在不同季节种植其收获始期表现有所不同，但变化不明显，而收获始期为晚的变异株至M5后收获始期稳定为65～70 d，划分为晚熟类型，变异率降为0.88 %；MC9的M2单株出现收获始期为中～晚的变异，变异率为2.63 %，至M3单株后收获始期转回辐射前的极早～早，且部分植株雌花节位甚至比对照低，变异率降为0；MC143的M2单株未出现收获始期变异。说明60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉能引起部分基因型苦瓜后代出现收获始期的变异，有些变异能稳定地遗传给后代，有些变异可能不是由基因变异引起，不能稳定遗传给后代。

A：MC9的对照果实长度；B：MC9的M2变异株的变长果实；C：MC143的对照纺锤形果实；D：MC143的M2变异株的卵形果实；E：MC143的M2变异株的近球形果实A：Fruit length of the wild type MC9；B：Longer fruit on M2 plants of MC9；C：Spindle-shaped fruit of the wild type MC143；D：Oval fruit on M2 plants of MC143；E：Globose fruit of M2 plants of MC143图4 2个苦瓜材料后代的果实长度和果实形状变异代表Fig.4 Representative photos of fruit length and shape of the two bitter gourds tested

表6 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代果实收获始期的影响

表7 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其后代表型性状变异率的影响

注：“其中”表示果实皮色变异中包括性型和收获始期的变异。

Note:‘Wherein’ indicates that the fruit color variation includes both sexual type and mature time variation.

2.3 60Co-γ辐照苦瓜花粉授粉对其M2和M5表型性状变异率的影响

表7显示，MC6、MC9和MC143的花粉经60Co-γ辐照授粉后，M2的总变异率分别为3.54 %、8.55 %和5.26 %，至M5总变异率分别降为0.88 %、2.63 %和0，变异率降低主要是由于果形、果实皮色和收获始期等经田间种植后又恢复至辐照前的性状，如MC143产生果形变异和MC6产生果皮色变异的植株，说明60Co-γ辐照剂量为200 Gy时，可使不同类型苦瓜M2产生某些表型性状变化，但有些变化可能不是由基因变异引起，不能稳定地遗传给后代。

3 讨 论

诱变具有使突变性状较快稳定的特点，是创造新种质、选育新品种的有效途径，在作物品种遗传改良上占有重要地位。蔬菜诱变育种始于20世纪50年代，已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黄瓜等蔬菜新品种[14]，但利用花粉作为辐照材料进行苦瓜双倍体后代变异选择等的相关研究未见报道。本研究结果表明，苦瓜花粉萌发率随着60Co-γ射线辐照剂量的增加而下降，经辐照的花粉授粉后均能使果实膨大，且平均单瓜种子数随着辐照剂量的增加而减少，当辐照剂量为300和350 Gy时，未收获到有胚种子，说明苦瓜花粉萌发率与果实膨大无相关性。

低剂量射线照射作物的花粉可有效克服远缘杂交的不亲和性，促进种间、属间远缘杂交[15-17]。葫芦科蔬菜利用辐照花粉授粉的目的是获得单倍体植株[9-11]，但未见对其后代进行变异选择的报道。本研究选用3种类型苦瓜花粉进行辐照后授粉，对其后代变异表型性状进行田间鉴定，结果表明，200 Gy剂量60Co-γ射线辐照花粉授粉能有效促使MC6、MC9和MC143苦瓜的M2表型性状产生变异，总变异率为3.54 %～8.55 %，种植至M5时，总变异率降低为0～2.63 %。变异率变低一是由于苦瓜的花芽分化受温度和光照影响，雌性状况和收获始期等性状发生改变[18]；二是果实皮色受光照影响，使同一个苦瓜的遮阳部分与充分暴露在阳光下的部分着色存在较大差异；三是由于在M2时测定的果实长度是单株变异，未取得《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 苦瓜》中规定的主蔓上第二个商品瓜的平均测量值，导致数值出现较大偏差。因此，不能稳定遗传给后代苦瓜性状的变异是否真正由基因变异引起，还有待研究证实。

4 结 论

以不同剂量60Co-γ射线进行苦瓜花粉辐照可获得苦瓜果皮色和性型变异株的稳定后代，说明辐照花粉授粉也是苦瓜辐照诱变育种的有效途径之一，其中200 Gy辐照苦瓜花粉后授粉能使部分基因型苦瓜产生稳定变异，而利用辐照花粉授粉的方法进行苦瓜新种质创制时，花粉的辐照剂量不宜高于300 Gy。