安罗替尼联合5-氟尿嘧啶抑制结肠癌的增殖和血管生成

杨 茜，文庆莲

(西南医科大学附属医院 肿瘤科，四川 泸州 646000)

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在所有恶性肿瘤中排名第三[1]。 2017年，结肠癌发病人数达180万例，十年内其发病率增加了38%，其中89.6万人死亡[2]。结肠癌目前治疗方式是以手术和化疗为主，然而，仍有约50%的结肠癌患者出现了远处转移[3-4]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用的消化道肿瘤的化疗药物，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，而干扰 DNA 的合成。但由于肿瘤细胞易耐药或个体差异等原因部分患者治疗效果欠佳[5]，因此，需要不断寻找更好的临床疗法来治疗结肠癌。

安罗替尼是我国自主研发的一种新型、口服的小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够有效抑制血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、 纤维母细胞生长因子受体 (Fibroblast growth factor receptor，FGFR)、干细胞因子受体(c-Kit)等激酶，相比于其他酪氨酸激酶抑制剂能抑制更多的靶点，且具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用[6-7]，并在多种实体瘤(包括非小细胞肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺髓样癌和软组织肉瘤)中表现出良好的抗肿瘤活性[8-11]。Wang等[12]研究发现MicroRNA-940通过靶向MACC1(结肠癌相关转移基因-1)的mRNA抑制结直肠细胞的增殖和侵袭，增强安罗替尼对结直肠癌的抗肿瘤作用，表明安罗替尼对于结肠癌的治疗是一个有效的药物，然而安罗替尼联合化疗或者其他治疗是否能增强对结肠癌的抗肿瘤效应，尚未有定论。本文旨在探讨安罗替尼联合5-氟尿嘧啶对结肠癌的抗肿瘤作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 安罗替尼由中国正大天晴医药有限公司提供，氟尿嘧啶注射液购自天津金耀集团有限公司； DMEM 高糖培养基、胎牛血清购自于美国 HyClone 公司；MTT 、结晶紫购自于上海碧云天生物科技有限公司； Transwell 小室，直径为 6.5 mm，孔径为 8 μm ，购自于美国 Corning 公司；基质胶购自于美国 BD 公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD Biosciences 公司；鼠抗人 Ki-67 和 CD31 抗体购自美国 Bio-World 公司；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，流式细胞仪(BD / FACSVerse，美国)， 酶标仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 细胞培养及动物 结肠癌CT26细胞株由西南医科大学附属医院肿瘤科实验室提供，将 CT26 细胞用含 10% 的胎牛血清的 DMEM 完全培养基在恒温培养箱中常规培养。48只 BALB/c-nu (SPF级) 小鼠购自于成都达硕动物实验中心(生产许可证：SCXK(川)2015-030；使用许可证：SYXK(川)2018-065)， 4 ～ 6 周龄，雌性，体重 18 ～ 20 g，饲养于无特定病原体条件。

1.3 MTT 细胞增殖实验 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为 5×104个/mL，接种到 96 孔板(5 000细胞每孔)并于37℃孵箱培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的安罗替尼(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L)、不同浓度 5-FU(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)、 NS 、安罗替尼(4 μmol/L)、 5-FU (5 μg/mL)以及联合组(安罗替尼 4 μmol/L+ 5-FU 5 μg/mL)作用 24 h 后，每孔加入 20 μL MTT， 37 ℃ 孵育 4 h，然后加入 150 μL DMSO，用酶标仪 490 nm 波长处测定吸光度并计算细胞抑制率：细胞活性率=实验组 OD 值/对照组 OD 值× 100 %。

1.4 Transwell 细胞侵袭转移实验 制备细胞悬液前撤血清饥饿细胞 12 h ，在 Transwell 小室内加入基质胶，等待凝固后取 CT26 细胞悬液(浓度为 5×105个/mL) 100 μL加入Transwell小室，下室加600 μL含20%血清的培养基，Transwell小室用含有安罗替尼(4 μmol/L)、5-FU (5 μg/mL)以及联合组(安罗替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)的无血清培养基作用 24 h。取出小室， PBS洗2遍，用甲醛固定30 min，倒置风干，加入结晶紫染色15 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS 清洗 3 遍，在 400 倍倒置显微镜下随机 5 个视野观察细胞并计数。

1.5 流式细胞凋亡实验 将 CT26 细胞制备成 5×105/mL的细胞悬液接种于6孔板，过夜后加入含有安罗替尼(4 μmol/L)、 5-FU(5 μg/mL)以及联合组(安罗替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)的培养基再培养24 h。消化、离心细胞后用遇冷的 PBS洗涤2次，加入Annexin Ⅴ- FITC/PI各5 μL，室温避光反应15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 肿瘤模型的建立与治疗 在48只BALB/c小鼠的右大腿皮下注射0.1 mL浓度为1×107/mL的CT26细胞悬液，建立皮下结肠癌瘤模型。约2周后所有小鼠右大腿皮下长出体积约150～200 mm3的肿瘤。将带瘤小鼠随机分为4组(n=12)：NS组，安罗替尼组(2 mg/kg/d)，5-FU组(20 mg/kg/d)，联合组(安罗替尼2 mg/kg/d+5-FU 20 mg/kg/d)，安罗替尼以灌胃方式给药治疗，5-FU以腹腔注射方式给药，待21 d后处死小鼠，并采集肿瘤组织进行进一步免疫组化分析。在治疗过程中，每隔4天用游标卡尺测量1次肿瘤大小，肿瘤体积V=a×b2×0.5(a代表肿瘤最长径，b代表肿瘤最短径)。本课题已经四川省西南医科大学动物保护和应用委员会批准。

1.7 免疫组化 将所有石蜡包埋的组织蜡块切成 4 μm 切片进行脱蜡和水化，抗原修复后，在切片上滴加鼠抗人 Ki-67 抗体(体积稀释比例为1∶50)及CD31抗体(体积稀释比例为1∶10)， 4 ℃反应过夜 ；滴加二抗， 37 ℃ 反应 20 min ；加入DAB溶液显色，苏木精复染，并使用树脂进行封固。在倒置相差显微镜下用400倍镜放大观察每一个病理切片，选择5个视野，计算Ki-67的阳性表达率：Ki-67 阳性率=阳性着色细胞/一个高倍视野下的细胞数×100 %。并对微血管的数量进行计数，取其平均值作为肿瘤组织中微血管的密度(MVD)。

2 结果

2.1 各组对结肠癌 CT26 细胞增殖活性的抑制作用 如图1A、B所示，不同浓度的安罗替尼(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L)和不同浓度5-FU(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)均能抑制结肠癌细胞 CT26 的活性，并随着浓度增大其细胞活性降低，显示出明显的浓度依赖性。从中选取罗替尼 4 μmol/L和 5-FU 5 μg/mL作为适宜的浓度，分别与生理盐水以及联合组(安罗替尼 4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)共同培养，我们发现联合组对细胞的活性的抑制率明显高于单用安罗替尼或 5-FU 组(P<0.05,见图1C)，表明安罗替尼联合5-FU可显著抑制结肠癌 CT26 细胞的增殖活性。

A、B：不同浓度安罗替尼和5-FU对细胞增殖活性的抑制曲线；C：各组的细胞抑制率(*：与联合组相比，P<0.05)。图1 各组对结肠癌 CT26 细胞增殖活性的作用

2.2 各组对结肠癌 CT26 细胞侵袭能力的影响 如图2A所示，与生理盐水组相比较，安罗替尼组(4 μmol/L)、 5-FU 组(5 μg/mL)以及联合组(安罗替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)均能够使穿过Transwell 小室膜的细胞减少。图2B对各组细胞侵袭数量的定量分析显示，联合组对结肠癌 CT26 细胞侵袭能力的抑制作用最大(P<0.05)，这说明安罗替尼联合 5-FU 对结肠癌 CT26 细胞侵袭具有更好的抑制作用。

A：各组细胞侵袭的图像(400×)；B：各组细胞侵袭的数量；*：与联合组相比，P < 0.05。图2 各组对结肠癌 CT26 细胞侵袭能力的影响

2.3 各组对结肠癌 CT26 细胞凋亡的影响 联合组(安罗替尼 4 μmol/L+ 5-FU 5 μg/mL)的细胞凋亡率(90.07 ± 3.10%)显著高于生理盐水组(9.34 ± 2.55%，P<0.05)，也明显高于安罗替尼组(4 μmol/L)的细胞凋亡率(25.56 ± 2.42%，P<0.01)和5-FU 组(5 μg/mL)的细胞凋亡率(33.98 ± 3.53%,P<0.05)(见图3)，表明了安罗替尼联合 5-FU 可显著的促进结肠癌 CT26 细胞的凋亡从而抑制细胞的增殖。

A：各组的细胞凋亡图像；B：各组的细胞凋亡率(与联合组相比*：P < 0.05)。图3 各组对结肠癌 CT26 细胞凋亡的影响

2.4 各组对小鼠结肠癌皮下移植瘤体积增长的影响 采用小鼠结肠癌皮下移植瘤模型来评估单药及联合用药在小鼠体内的抗肿瘤作用，结果显示(见图4)，与生理盐水组相比，安罗替尼2 mg/kg灌胃治疗后，小鼠的皮下移植瘤生长稍有抑制，但差异没有统计学意义(P>0.05)，而5-FU 20 mg/kg腹腔注射治疗及联合组(安罗替尼2 mg/kg+5-FU 20 mg/kg)治疗后，小鼠的皮下移植瘤生长受到明显抑制，且联合组的抗肿瘤生长效应更佳，说明了安罗替尼联合5-FU在体内同样发挥了良好的抗肿瘤作用。

A：各组小鼠结肠癌皮下移植瘤的图像；B：各组治疗后21 d皮下移植瘤的体积；*：与NS组相比，P<0.05。图4 各组对小鼠结肠癌皮下移植瘤体积增长的影响

2.5 各组小鼠肿瘤组织中 Ki-67 和 CD31 的表达情况 不同药物治疗后小鼠肿瘤组织中Ki-67 阳性表达和微血管密度情况(见图5A)。经图5B所示的定量分析，我们发现与生理盐水组(53.13 ± 3.46%)、单药安罗替尼组(2 mg/kg)(41.03 ± 1.26%)、单药 5-FU(20 mg/kg)(30.66 ± 0.34%)组相比，联合组(安罗替尼 2 mg/kg +5-FU 20 mg/kg) 的Ki-67 阳性表达率(16.74 ± 1.79%)显著降低(P< 0.05)，安罗替尼与 5-FU 联合治疗后肿瘤细胞增殖抑制作用增强。图5C表明单药 5-FU 组在小鼠肿瘤组织中微血管密度(11.6 ± 1.02)与生理盐水组(13.2 ± 0.74)相比，不存在统计学差异(P> 0.05)，不具有抗血管生成作用。而与安罗替尼联合作用后，联合组的微血管密度与单药 5-FU 组相比(2.8 ± 0.75 VS 11.6 ± 1.02，P< 0.05)显著下降，抗血管生成作用明显增强。

A：各组小鼠肿瘤组织中Ki-67(上图)和 CD31(下图)的表达图像(400×)；B：各组小鼠肿瘤组织中 Ki-67 阳性表达率；C：各组小鼠肿瘤组织中的微血管密度(MVD)；*：与联合组相比，P<0.05。图5 各组小鼠结肠癌皮下移植瘤中Ki-67和CD31的表达情况

3 讨论

结肠癌是与遗传因素和饮食习惯密切相关的疾病，在我国其发生率以平均每年4%～5%的增速逐年增加[13]，严重威胁人类健康和生命。除了传统的手术及化疗以外，分子靶向药物应用于临床极大地改善了结直肠癌患者的预后，使总生存期(Overall survival， OS)由过去的 6 ～ 12 个月延长至将近 30 个月[14]。临床上批准用于结直肠癌的靶向治疗药物包括:表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor，EGFR)抑制剂代表药物西妥昔单抗和帕尼单抗、抗血管生成抑制剂代表药物贝伐单抗、阿柏西普和雷莫芦单抗以及小分子酪氨酸激酶抑制剂代表药物瑞戈非尼和呋喹替尼[15]，但由于个体差异缺乏基因突变或缺失等引起的原发性耐药或使用药物治疗后引起的继发性耐药等原因使部分患者治疗效果欠佳或出现疾病的进展，因此，我们需要不断探究新的治疗药物及治疗方法。

安罗替尼是一个多靶点酪氨酸激酶抑制剂，大多数据表示，其对非小细胞肺癌[16]、骨肉瘤[17]、甲状腺癌[18]以及肝癌[19]均具有良好的抗肿瘤及抗血管生成作用。Sun 等[20]开展的一项I期临床试验评估了安罗替尼治疗21例晚期难治性实体瘤的安全性及抗肿瘤作用，初步表明安罗替尼对结直肠癌具有抗肿瘤作用。目前，关于安罗替尼在结直肠癌中抗肿瘤作用的临床研究正初步开展，一项单臂Ⅱ期临床研究纳入了31例经标准治疗失败或缺乏标准治疗的转移性结直肠癌患者[21]，研究结果显示客观缓解率(Objective response rate，ORR)为 6.45%，疾病控制率(Disease control rate,DCR)为 87.1%，中位无进展生存期(Medical progression free survival，mPFS) 为 5.62 个月(95%CI：3.80～7.32)，中位总生存期(Medical overall survival，mOS)为 9.33 个月(95%CI：8.64～10.21),表明单药安罗替尼对晚期结直肠癌的治疗具有良好抗肿瘤疗效。

本研究体外实验表明安罗替尼能够抑制结肠癌 CT26 细胞的增殖和侵袭，并能促进细胞的凋亡。在此基础上，我们联合5-氟尿嘧啶化疗药物，与单药安罗替尼或5-氟尿嘧啶相对比，联合组显著增强了对结肠癌 CT26 细胞活性的抑制作用，降低了细胞的侵袭能力，并使细胞凋亡率大大增加。结直肠癌的发展和转移通常伴随着肿瘤细胞的增殖、分化和克隆，因此，抗肿瘤药物的疗效取决于对肿瘤细胞活性、增殖、迁移和侵袭的影响。我们认为安罗替尼通过抑制结肠癌 CT26 细胞的增殖活性，促进细胞凋亡从而在联合5-FU后增强了抗肿瘤的效应。为了评估单药组及联合用药组在小鼠体内的抗肿瘤作用，我们进一步建立了小鼠结肠癌皮下移植瘤模型，结果表明联合组的抗肿瘤生长效应更佳，说明了安罗替尼联合 5-FU 在体内同样发挥了良好的抗肿瘤作用。

肿瘤组织中血管形成为肿瘤细胞提供了的氧气和营养，在肿瘤的侵袭及远处转移中也发挥了重要的作用[22-23]，Xie 等研究显示安罗替尼对 VEGFR2 和 VEGFR3 的表达活性具有强烈的抑制作用，同时对 PDGFR 和 FGFR 途径也有较强的抑制作用，因此能够全面阻断肿瘤血管生成[24]。小鼠肿瘤组织的免疫组化显示，单药 5-FU 组的 Ki-67 阳性表达率降低，但微血管密度定量与生理盐水组不存在统计学差异(P> 0.05)。而单药安罗替尼组 Ki-67 阳性表达率和微血管密度定量均降低，表明安罗替尼具有双重抑制肿瘤增殖及血管形成的作用。与生理盐水组、单药5-FU 或安罗替尼组相比，联合组药物作用能显著降低肿瘤组织中的 Ki-67 阳性表达率和微血管密度(P< 0.05)。表明安罗替尼联合5-FU 能够增强对肿瘤细胞增殖和血管生成的抑制作用，进而提高了对结肠癌的治疗疗效。

综上所述，本研究证明了安罗替尼可能在5-氟尿嘧啶的作用基础上增强了对结肠癌细胞增殖、侵袭和肿瘤血管生成的抑制作用，达到了更好的抗肿瘤效应。我们的数据加深了对安罗替尼联合化疗治疗结直肠癌的理解，但仍需要进一步探究与其相关分子机制，更需要大样本的临床试验来证明。