两种水源性诺如病毒富集方法的比较

冯微宏, 肖 勇, 钱燕华, 许秋瑾

1.南京医科大学公共卫生学院全球健康中心，江苏 南京 211166 2.无锡市疾病预防控制中心，江苏 无锡 214023 3.中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

诺如病毒是一种重要的水传播病毒，被认为是最常见的急性胃肠炎的病原学病毒[1-3]. 诺如病毒是无包裹的单股正链RNA病毒，其基因组可以分成3个开放阅读框(ORF). 基于其衣壳蛋白核酸序列的不同，诺如病毒可以分为5个不同的基因型(G Ⅰ～G Ⅴ)，其中G Ⅰ型和G Ⅱ型通常感染人类，而且这两型可进一步细分为至少31个不同的基因亚型[4]. 诺如病毒主要通过食物、水和人传人3种途径传播[5-6]，人传人可以借由直接接触患者或吸入患者呕吐物的气溶胶两种途径而感染[7].

自1992年诺如病毒全基因组序列被解析以来，虽然诺如病毒的分子检测方法已经改进了很多，但水中诺如病毒的检测始终是个难点，成为诺如病毒暴发疫情溯源的瓶颈. 自然水体中诺如病毒检测困难，主要原因是：①目前，诺如病毒还不能进行体外培养. ②原始水样中病毒含量很低，低于常规荧光定量RT-PCR (反转录酶-聚合酶链反应)方法的检测下限. ③水中存在一些抑制RT-PCR的物质[8-9]. 目前最广泛使用的水体中诺如病毒的富集方法是病毒吸附-洗脱(VIRADEL)法，其可以分为阴离子膜吸附-洗脱法和阳离子膜吸附-洗脱法[10-11]. 这两种方法针对不同病毒的回收效果及使用成本等方面有差异，为找到一个各方面更适用于日常水体中诺如病毒富集的吸附-洗脱方法，该研究模拟比较了这两种方法对水体中诺如病毒的回收效果、富集消耗时间、适用场景及使用成本的差异，旨在优选水源性诺如病毒富集方法，为水源水、饮用水以及自然景观水体(如湖滨浴场)中诺如病毒的常规监测贮备检测技术和方法.

1 材料与方法

1.1 GⅡ型诺如病毒标本液的制备

取1 mL由无锡疾病预防控制中心微生物检验部实验室检出的GⅡ型诺如病毒阳性的粪便标本，加到10 mL灭菌水中，充分振荡混匀后，以 4 000×g离心5 min，取上清液通过0.45 μm针头式过滤器过滤，再用PBS (磷酸缓冲盐溶液)稀释后，分装成每管1.0 mL，作为原始病毒标本液，并于-80 ℃下保存备用.

1.2 试剂与仪器

One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit购自宝日医生物科技(北京)有限公司(货号：RR064a)；RNA提取试剂盒Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自德国Qiagen公司(货号：52906)；含有GⅡ型诺如病毒特征性片段的质粒由无锡疾病预防控制中心微生物检验部构建，构建步骤参考文献[12]；UNIQ-200柱式质粒DNA中量抽提试剂盒购自上海生工生物科技有限公司(货号：B511241)；DH5α感受态细菌购自上海生工生物科技有限公司(货号：B528413)；ABI 7500 Fast型实时荧光PCR仪购自美国ABI公司；0.45 μm硝酸纤维素滤膜(直径14.2 cm)购自美国Millipore公司(货号：HAWP14250)；0.45 μm针头式过滤器购自上海生工生物有限公司(货号：F513143-0001)；HE120型水平式核酸电泳仪购自上海天能科技有限公司；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机(货号：5407000368)和Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白测定仪(货号：10021)购自德国Eppendorf公司；Gel Doc XR+凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司(货号：5838)；WT600-2J型精密蠕动泵及配套硅胶软管购自保定兰格恒流泵有限公司；PurLVsTM真空抽滤系统购自北京卓诚惠生生物科技有限公司；NanoCeram滤器购自美国Argonide公司；Centricon Plus-70超滤管购自美国Millipore公司(货号：C3043).

1.3 引物探针

根据Trujillo等[13]的研究，合成引物探针，用于荧光定量PCR检测GⅡ型诺如病毒和含有GⅡ型诺如病毒特异性片段的标准质粒. 引物探针由上海生工生物科技公司合成. 荧光定量RT-PCR所用引物和探针序列见表1.

表1 荧光定量RT-PCR所用引物及探针序列

注：** 表示G Ⅱ TaqMan®探针；5′端用JOE荧光素标记，3′端用BHQ淬灭基团标记.

1.4 RNA提取及荧光定量PCR检测

RNA提取按照Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒操作说明书进行. RNA提取完成后进行荧光定量RT-PCR检测. 荧光定量RT-PCR检测通过ABI 7500Fast型实时荧光PCR仪完成. 反应体系：2×Quantitech probe RT-PCR Master Mix 12.5 μL、Cog 2F (10 μmol/L) 1 μL、Cog2R (10 μmol/L) 1 μL、Ring 2 (10 μmol/L) 0.5 μL、Quantitech RT Mix 0.25 μL、Rnase-free H2O 7.25 μL和模板RNA 2.5 μL. 反应参数: 50 ℃ 30 min, 95 ℃ 15 min, 94 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，共40个循环，60 ℃收集荧光信号.

1.5 病毒浓度及Ct值计算

将含GⅡ型诺如病毒特异性扩增片段的质粒转化到DH5α感受态细菌，经培养扩增后，使用UNIQ-200柱式质粒DNA中量抽提试剂盒抽提质粒，采用Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白测定仪测定浓度，质粒拷贝数根据质粒分子量及阿伏伽德罗常数(NA)进行计算，计算公式：

CdsDNA=50×OD260 nm×Dr

(1)

CNplasmid=CdsDNA/Mrplasmid×NA

(2)

式中：CdsDNA为双链DNA (dsDNA)的浓度，μg/mL；OD260 nm为dsDNA在260 nm紫外波长下的吸光度(1个吸光度值相当于50 μg/mL的双链DNA)；Dr为dsDNA的稀释倍数；CNplasmid为质粒(plasmid)的拷贝数浓度，copies/L；Mrplasmid为质粒的相对分子质量，g/moL；NA为阿伏伽德罗常数，取值为6.02×1023copies/mol.

将原始质粒浓度〔通过式(1)(2)计算得到〕稀释至8×1010copies/μL，再将其进行10倍逐级稀释为9个浓度(分别为8×109、8×108、8×107、8×106、8×105、8×104、8×103、8×102、8×101copies/μL)；用荧光定量PCR分别测得不同浓度下的Ct(荧光定量PCR中达到设定阈值所经过的循环数)，并重复3次. 取荧光扩增曲线Ct平均值和对应拷贝数的lg对数平均值绘制标准曲线，用荧光定量RT-PCR检测保存的诺如病毒悬液，根据标准曲线算出所含诺如病毒的拷贝数.

1.6 阴离子膜吸附-洗脱法

取0.1、1、5 mL病毒原液，加入到1 L灭菌水中，加入50 mL 2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+最终浓度为0.1 mol/L，充分搅拌混合均匀；采用真空抽滤使水样以0.1 L/min的速率通过孔径为0.45 μm的硝酸纤维素滤膜；将膜浸入pH为3.5的盐酸溶液中，5 min后取1/4大小的膜剪碎(最后病毒量换算时再乘以4)，用1 mL Tr alk洗脱液(0.05 mol/L KH2PO4, 1.0 mol/L NaCl, 0.1% Triton X-100, pH 9.2)4 ℃浸泡过夜洗脱，取200 μL洗脱液提取RNA，用荧光定量PCR进行检测. 试验重复3次，阴性对照使用1 L无病毒的无菌水，在核酸提取中加入阳性质粒作为阳性对照.

1.7 阳离子膜吸附-洗脱法

取0.1、1、5 mL病毒原液，加入到1 L灭菌水中，加入50 mL浓度为2 mol/L的MgCl2溶液，使Mg2+最终浓度为0.1 mol/L，充分搅拌混合均匀；以0.1 L/min的速率通过Nanoceram滤器，过滤完成后将Nanoceram滤膜浸泡于200 mL TGBE洗脱液(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.05 mol/L甘氨酸, 3% beef extract, pH为9.5)中，4 ℃浸泡过夜洗脱，洗脱液接着用Centricon plus-70超滤管以3 000×g离心30 min 浓缩至1 mL，取200 μL洗脱液提取RNA，用荧光定量PCR进行检测. 试验重复3次，阴性对照使用1 L无病毒的无菌水，在核酸提取中加入阳性质粒作为阳性对照.

1.8 病毒回收率计算

病毒回收率计算公式：

Recovery=CNrecovered sample/CNunseeded sample×100%

(3)

式中：Recovery为病毒回收率，%；CNrecovered sample为富集后病毒浓缩液中的病毒拷贝数浓度，copies/L；CNunseeded sample为富集前病毒原液中的病毒拷贝数浓度，copies/L.

1.9 统计分析

采用SPSS 16.0软件对数据进行整理和统计学分析. 病毒回收率和病毒浓度符合正态分布，采用平均值±标准差表示. 以病毒拷贝数的lg对数值为横坐标，以Ct为纵坐标，建立标准曲线，并计算R2. 使用方差分析比较阴离子膜吸附-洗脱法和阳离子膜吸附-洗脱法两种方法所得回收率的差异，如P<0.05认为有统计学意义.

2 结果与分析

图1 病毒绝对定量标准曲线Fig.1 Standard curve of absolute virus quantification

2.1 病毒拷贝数对数值与Ct呈线性关系

10倍梯度稀释后的GⅡ型诺如病毒质粒标准品在PCR扩增时呈现典型S型曲线，通过计算分析可得，在8×101～8×1010copies/μL时，标准曲线图见图1. 病毒拷贝数对数值lg (x)与Ct(y)关系为y=-3.567 8x+47.638(R2=0.997 6，P<0.001)，其可用于诺如病毒拷贝数的绝对定量. 病毒标本液提取核酸后用荧光定量PCR检测获得其Ct，并通过上述标准曲线计算出病毒拷贝数浓度为7.1×106copies/μL，为便于计算，用灭菌蒸馏水稀释至8×105copies/μL，作为试验中病毒原液使用.

2.2 两种不同方法的回收率

随着模拟水样中病毒浓度的降低，两种方法的回收率都相应降低. 当原始模拟水样中病毒浓度为8 copies/μL时，无论使用阴离子膜吸附-洗脱法还是阳离子膜吸附-洗脱法，3次重复试验都没有检测到病毒，而当原始模拟水样中病毒浓度为80、400 copies/μL时，阴离子膜吸附-洗脱法回收率分别为22.2%±4.1%和36.8%±6.2%；阳离子膜吸附-洗脱法回收率为17.4%±1.47%和28.8%±6.1%(见表2). 综上，阴离子膜吸附-洗脱法病毒回收率高于阳离子膜吸附-洗脱法(P<0.05).

表2 两种水源性诺如病毒富集方法的回收率比较

3 讨论

诺如病毒以高浓度存在于隐形感染者，即无典型症状感染者的粪便中，并主要通过粪口途径污染食物和水[14]. 水体中诺如病毒的检测已成为水源性诺如病毒暴发疫情的关键溯源手段[15]. 迄今为止，已有许多研究关注于各种类型水环境，如未经处理的废水、地表水、地下水、海水、甚至饮用水中诺如病毒的检测[10,16-17]. 由于在水体中诺如病毒浓度极低，所以在荧光定量PCR检测之前水体的富集浓缩成为必不可少的步骤. 之前很多研究使用了两级，即初级浓缩和次级浓缩的病毒富集法，其中VIRADEL法是初级浓缩中常用的方法，而超滤法和聚乙二醇(PEG)絮凝法是次级浓缩中常用的方法[10,18]. VIRADEL法基本过程是先使含有病毒的水体通过吸附性滤器，使病毒吸附在多孔滤膜上，再使用缓冲液从滤膜上洗脱病毒. VIRADEL法中最常使用两种滤膜，即阴离子膜和阳离子膜，因而VIRADEL法又可分为阴离子膜吸附-洗脱法和阳离子膜吸附-洗脱法. 阴离子膜最常用的是硝酸纤维素膜，阳离子膜常用的包括1MDS膜[19]和Nanoceram膜[20]. 1MDS阳离子膜是美国环境保护局(US EPA)推荐用于富集水中肠道病毒的滤膜[21]，但是1MDS价格非常昂贵[22-23]，而美国Argonide公司生产的由纳米氧化铝纤维组成的NanoCeram膜比1MDS膜便宜很多，而且在与1MDS膜的比较研究中发现其对自来水和河水中的肠道病毒的回收率高于1MDS膜[20,24]. 而硝酸纤维素膜的价格更为便宜，其只相当于Nanoceram膜价格的1/8，从使用成本上看阴离子膜吸附-洗脱法要比阳离子膜吸附-洗脱法便宜很多.

从洗脱过程来比较，对于阴离子膜吸附-洗脱法而言，在浓缩之前，需要添加阳离子盐(如MgCl2或AlCl3)来促进带负电的病毒与膜的结合[25]，在洗脱之前需要再用酸(H2SO4或HCl)洗去膜上吸附的阳离子(Mg2+或Al3+)以提高病毒回收率[26]，该研究中加入的阳离子选用MgCl2而不选用AlCl3的理由，在于有研究[27]发现随着水样体积的增加，添加AlCl3后水中病毒的回收率急剧下降，而添加MgCl2后病毒的回收率仍然保持稳定. 对阳离子膜吸附-洗脱法而言，在浓缩过程中无需加盐或酸化，但阴离子膜吸附-洗脱法在初级浓缩后，洗脱液体积可以小至1 mL，无需再进行次级浓缩而可以直接抽提核酸，相反阳离子膜吸附-洗脱法在初级浓缩后，洗脱体积仍为200～300 mL，为达到1 mL最终体积(保证两种方法最终洗脱液体积相同)，仍需要进行次级浓缩，PEG沉淀和超滤都是可选的方案[17,28-29]，但使用超滤法更合适，因为PEG沉淀需要4 ℃搅拌过夜再离心取沉淀溶解，而超滤只需离心30 min即可完成使得最终洗脱液体积在1 mL之内[30-32]，另外PEG中存在一些会抑制RT-PCR的物质[33]. 总体而言，阳离子膜吸附-洗脱法比阴离子膜吸附-洗脱法消耗时间更长，另外在次级浓缩中阳离子膜吸附-洗脱法需要用到超滤管和低温高速离心机，这无形增加了很多使用成本.

洗脱液的选择方面，De-Keuckelaere等[34]研究发现，Tr alk洗脱液(磷酸盐洗脱液)用来洗脱阴离子膜所得的病毒回收率较高，而TGBE用于洗脱阳离子膜所得的病毒回收率较高. 该研究结果显示，阴离子膜吸附-洗脱法的回收率总体稍高于阳离子膜吸附-洗脱法，与De-Keuckelaere等[34]研究结果一致. De-Keuckelaere等[34]研究发现，使用阴离子膜吸附-洗脱法的鼠诺如病毒(MNV-1)的回收率(平均为21.87%)要远高于阳离子膜吸附-洗脱法(1MDS膜)，其回收率平均仅为1.63%,而该研究显示阳离子吸附-洗脱法的病毒回收率要远高于De-Keuckelaere 等[34]的研究，原因可能是：①鼠诺如病毒和人诺如病毒的带电特性差异较大；②Nanoceram 膜的病毒回收率要高于1MDS膜[24].

从使用场景来比较，对阴离子膜吸附-洗脱法而言，需要事先在水体中加入阳离子(Mg2+)，很难进行现场处理，而阳离子膜吸附-洗脱法无需对水体进行任何处理，可适用于现场采样处理，但阳离子膜吸附-洗脱法相比阴离子膜吸附-洗脱法要多一个次级浓缩的步骤，这一过程在采样现场无法完成，所以总体而言二者都更适用于实验室操作. 综合富集效果、操作步骤和检测成本方面的考量，阴离子膜更适用于实际检测工作中水体的人诺如病毒富集. 此次方法学研究的结果，将在自然环境水体中诺如病毒的监测和研究中开展进一步的验证和不断改进.

4 结论

a) 从富集效果来比较，阴离子膜吸附-洗脱法回收率分别为22.2%±4.1%和36.8%±6.2%，阳离子膜吸附-洗脱法回收率分别为17.4%±1.5%和28.8%±6.1%，说明前者对病毒的富集回收率显著高于后者(P<0.05).

b) 从操作步骤来比较，阴离子膜吸附-洗脱法比阳离子膜吸附-洗脱法更简便，耗时更短.

c) 从成本来比较，阴离子膜吸附-洗脱法总体比阳离子膜吸附-洗脱法低很多.

d) 综合富集效果、耗费时间和成本等因素，阴离子膜吸附-洗脱法比阳离子膜吸附-洗脱法更适用于常规水体监测中水源性诺如病毒的富集.