泡核桃不同器官多酚类物质组分及含量差异分析

2020-07-01 02:35陆胜波史斌斌张文娥潘学军
经济林研究 2020年2期
关键词:青皮种皮酚类

陆胜波,史斌斌,张文娥,潘学军

(1.贵州大学 农学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州省果树工程技术研究中心,贵州 贵阳 550025)

核桃作为重要的坚果和木本油料树种,具有很高的经济价值。目前,核桃Juglans regiaL.与泡核桃Juglans sigillataDode 是我国的两种主栽类型[1], 泡核桃又称为茶核桃、铁核桃、漾濞核桃,是西南地区特有的核桃种质资源,广泛分布于云南、贵州、四川和西藏的雅鲁藏布江中下游等地区,现今云南、贵州等省的核桃种植面积近百万公顷[2-3], 核桃生产已成为助推农业发展和乡村振兴的重要产业。核桃生产周期长,目前很多核桃树仍处于种植期或挂果初期,还没有形成稳定的经济效益,这在一定程度上挫伤了林农管理的积极性。核桃树体冠幅较大,其枝叶量多,多数情况下因修枝、剪叶和剥离青皮、内种皮而产生的附属物都被废弃,导致了资源浪费和环境污染等问题[4-5]的产生,若能合理利用这些废弃物,对于缓解前期种植压力和增加果农收入都很有帮助。

许多研究结果都表明,核桃含有丰富的多酚类物质,这类物质具有抑菌、抗氧化、降血脂、防衰老等功效[6-8]。目前关于核桃多酚类物质的研究报道很多,相关研究从多酚类物质的提取、分离鉴定和功能成分的体外试验等方面进行,其中,多酚物质的分离鉴定始终是相关研究的重点,是认识和利用多酚物质的前提[9-10]。Solar 等[11]在1年生核桃枝条中检出了香草酸、丁香酸、鞣花酸、绿原酸、儿茶素、杨梅素、胡桃醌和1,4-萘醌等8 种酚类物质。田平平等[12]从核桃青皮中检出了绿原酸、短叶苏木酚羧酸、花靛-葡萄糖/半乳糖、鞣花、槲皮素-阿拉伯糖、表儿茶素或儿茶素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷等7 种强抗氧化活性成分。Joana 等[13]从核桃叶片中鉴定出了3-咖啡酰奎宁、3-对香豆酰奎宁、4-对香豆酸奎宁、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、槲皮素-3-木糖苷、槲皮素-3鼠李糖苷和2 种山奈酚戊糖苷衍生物。Regueiro 等[14]应用LC-MS 联用技术从核桃仁中鉴定到了酚酸、黄酮、鞣质、水解单宁和缩合单宁等120 种酚类化合物。万政敏等[15]还从核桃仁的内种皮中检测到了17 种酚酸类和8 种黄酮类物质,其中没食子酸是酚酸类含量最高的物质,芦丁是黄酮类含量最高的物质。这些研究结果表明,核桃的根、枝、叶片、青皮、内种皮等器官中均含有丰富的多酚物质,是开发和利用多酚的良好植物源。

目前,很多研究都只局限于核桃仁或核桃青皮等单一器官上,而系统评价核桃不同器官中多酚物质的报道却较少。多酚类物质在核桃器官中分布广泛,且各自组分和含量存在差异,弄清核桃各器官中酚类物质的组分及含量是其合理开发利用的前提。为此,本研究以我国西南地区特有的泡核桃Juglans sigillataDode 优良品种‘黔核6号’和‘黔核7 号’为材料,对其不同器官中酚类物质的组分及含量进行了鉴定和分析,以期为深刻认识与合理利用核桃不同器官中的多酚物质提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地处于贵州省毕节市赫章县财神镇(27°13′N、104°71′E),平均海拔为1 750 m,属于温带季风性气候。气温日差较大而年差较小,年均温为10.0 ~13.6 ℃,最高气温33.6 ℃,最低气温-3.0 ℃。年总积温为3 650 ~4 964 ℃,年均降水量为785.5 ~1 068.0 mm,全年降水集中在6—8月,全年平均降水日174 d,日照时数1 260.8 ~ 1 548.3 h,无霜期210 ~250 d。光照条件较好,太阳辐射较高。试验地为平缓坡地,排水状况良好,土壤类型为沙质黄壤土。

1.2 试验材料

供试核桃品种为本课题组前期筛选的酚类物质含量差异较大的两个泡核桃Juglans sigillataDode 品种‘黔核6 号’和‘黔核7 号’,以其树龄为38 a 的实生大树为供试材料。

于2016年9月采集其成熟期的须根(树冠滴水线50 ~60 cm 深处的须根,直径为1 ~5 mm, 分别从东、南、西、北4 个方位采集,每个方位各随机采集50 g,共200 g)、树冠中部外围的 1年生枝条(每个方位各随机取结果枝5 段,共20 段)、叶片(结果枝基部复叶的第2 片小叶,每个方位各随机采取10 片叶,共40 片叶)、果实(每个方位各随机取5 个果,共20 个果)。

将上述样品放入0 ℃的密闭冰盒中带回实验室,先用自来水冲洗干净,再用蒸馏水涮洗幷晾干,将所采果实分别按青皮、内种皮、去皮种仁 3 个器官分离。将样品迅速用液氮冷冻捣碎混匀,分装后存放于-80 ℃的超低温冰箱中以备用。

1.3 方 法

1.3.1 主要仪器及药品

仪器:LC-15C 型高效液相色谱仪(带自动进样 器),日本岛津;UV-2550 型紫外可见分光光度计,日本岛津;KQ5200DE 型超声波清洗仪,昆山超声仪器;SORVALL®Stratos 型高速冷冻离心机,美国赛默飞。

药品:Folin-酚试剂、普通甲醇、色谱甲醇,碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠,除色谱甲醇外均为分析纯试剂,均购买于北京宝莱生物科技有限公司;绿原酸、香草酸、没食子酸、鞣花酸、芦丁、表儿茶素、丁香酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香醛、对香豆酸、儿茶素、杨梅素、槲皮素、胡桃醌标准品,均购买自美国Sigma 公司。

1.3.2 多酚提取

采用超声波辅助法[16](略有改进)提取多酚:称取0.5 g 鲜样组织,加入50%的甲醇10 mL,充分研磨,在50 ℃下以超声波清洗仪40 kHz 辅助提取40 min,接着经5 ℃冷冻离心机以8 000 r·min-1的转速离心10 min,取上清液,用50%甲醇定容至10 mL,即为多酚提取液。

1.3.3 总酚、总黄酮及单体酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu 法[17]测定总酚含量;采用铝离子络合法[18]测定总黄酮含量;采用高效液相色谱法[19]测定单体酚含量。

1.4 数据统计及分析

所有样品测试均设3 次生物学重复。采用Excel 2010 软件进行数据统计与作图,采用SPSS 19.0 进行方差分析,采用Duncan 新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 标准品的高效液相色谱分析

在既定的色谱条件下,没食子酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、表儿茶素、儿茶素标准品混合液于280 nm 处测定,结果如图1A 所示;鞣花酸、杨梅素、槲皮素、芦丁、胡桃醌标准品混合液在251 nm处测定,结果如图1B 所示;15 种多酚物质在35 min 内可全部分离,且其峰形和分离效果均较好,均能满足酚类物质的检测。

图1 分别在251 和280 nm 处测定的标准品色谱图Fig.1 Standard chromatograms measured at 251 and 280 nm

2.2 不同器官中总酚和总黄酮的含量分析

‘黔核6 号’和‘黔核7 号’不同器官中总酚和总黄酮含量的检测结果如图2 所示。从图2中可以看出,两个品种不同器官中总酚、总黄酮的含量差异显著。叶片中的总酚含量,‘黔核6 号’略高于‘黔核7 号’;内种皮和根中的总黄酮含量,‘黔核7 号’略高于‘黔核6 号’;其余器官中的总酚和总黄酮含量,两个品种相差均较小。总酚含量,不同器官间的差异均达到显著水平;内种皮显著高于其它器官,而去皮种仁显著低于其它器官。‘黔核6 号’各器官中的总酚含量,叶片显著高于枝和根;而‘黔核7 号’各器官中的总酚含量,根显著高于叶和枝。总黄酮含量,除‘黔核7 号’的枝和根、青皮和去皮种仁间其含量均无差异外,其余器官间其总黄酮的含量差异均达到显著水平,且其含量大小顺序为内种皮>叶>枝>根>青皮>去皮种仁。总体而言,内种皮的总酚、总黄酮含量整体表现最高,叶、枝、根次之,青皮中的含量中等,去皮种仁中的含量最低。

图2 两个品种不同器官的总酚和总黄酮含量Fig.2 Contents of total phenolic and total flavones in different organs of two varieties

2.3 不同器官中多酚的组分及含量分析

‘黔核6 号’和‘黔核7 号’相同器官中多酚的组分基本相同而含量略有差异,而两个品种不同器官中多酚的组分及含量的差异均明显,检测结果见表1 ~2。从供试材料中共检出14 种多酚物质:酚酸类8 种,包括咖啡酸、对香豆酸、没食子酸、绿原酸、香草酸、丁香酸、丁香醛、阿魏酸;黄酮类5 种,包括儿茶素、表儿茶素、杨梅素、槲皮素、芦丁;萘醌类1 种,即胡桃醌。其中,没食子酸、对香豆酸、咖啡酸、丁香酸和芦丁在所有器官中均可检测到,绿原酸、阿魏酸和丁香醛在除去皮种仁外的其它器官中均可检测到;儿茶素在除枝外的其它器官中均可检出,表儿茶素只在根、枝和青皮中才可检出;槲皮素只在叶片、内种皮和去皮种仁中才可检出;杨梅素只在根和青皮中才可检测到;香草酸只在青皮中才可检测到;胡桃醌在除内种皮和去皮种仁外的其它器官中均能检出。

根和内种皮是酚类物质总含量最高的两个器官。从‘黔核6 号’和‘黔核7 号’的根中检测到11种单体酚,其酚类总含量的变异范围为10 571.5~ 12 326.1 μg·g-1;从‘黔核6 号’和‘黔核7 号’的内种皮中检测到10 种单体酚,其酚类总含量的变异范围为9 371.8 ~13 306.1 μg·g-1。叶片、枝和青皮中酚类物质的含量水平均为中等,其中,叶片中酚类总含量的变异范围为3 538.6 ~ 4 938.6 μg·g-1,青皮中酚类总含量的变异范围为 3 060.2 ~3 720.9 μg·g-1;从‘黔核6 号’和‘黔核7 号’的叶片与青皮中均检测到了12 种单体酚(从‘黔核6 号’的青皮中只检出10 种)。‘黔核6 号’和‘黔核7 号’的枝中均检测到11 种单体酚,其酚类总含量的变异范围为1 927.6 ~ 2 009.8 μg·g-1。去皮种仁是多酚组分及含量最少的器官,从‘黔核7 号’的去皮种仁中可检出7 种单体酚,而从‘黔核6 号’的去皮种仁中只测到 6 种单体酚,两个品种去皮种仁中酚类物质总含量的变异范围为32.7 ~58.8 μg·g-1。

在检测到的酚酸类物质中,绿原酸是含量最高的酚酸类物质,其次是没食子酸,而咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、丁香酸等酚酸类物质的含量均较少。绿原酸是核桃叶片、枝、青皮等器官中的主要酚酸类物质。绿原酸在叶片中的含量最高,其在‘黔核6 号’与‘黔核7 号’叶片中的含量分别为1 757.1、734.5 μg·g-1;另外,‘黔核7 号’的内种皮中也有较高含量的绿原酸,其含量为574.8 μg·g-1。黄酮类物质中,芦丁的含量最高,其平均含量为1 777.6 ~2 650.9 μg·g-1。各器官中的芦丁含量,内种皮显著高于其它器官;‘黔核6号’和‘黔核7 号’内种皮中的芦丁含量分别为12 636.2 与8 092.1 μg·g-1。胡桃醌是含量最高的酚类物质,其在‘黔核6 号’与‘黔核7 号’的平均含量分别为3 588.8、4 088.2 μg·g-1,是根、青皮、枝等器官中含量最高的单体酚;且其在根中的含量显著高于在其它器官中的含量,其在‘黔核6 号’和‘黔核7 号’的根中的含量分别为9 623.5、 11 843.0 μg·g-1。

表1 ‘黔核6 号’不同器官中多酚的组分及含量†Table 1 Components of polyphenols and their contents in different organs of ‘Qianhe 6’ μg·g-1

表2 ‘黔核7 号’不同器官中多酚的组分及含量Table 2 Components of polyphenols and their contents in different organs of ‘Qianhe 7’ μg·g-1

2.4 不同器官中多酚物质的含量分布情况

两个核桃品种不同器官中酚类物质的含量分布情况如图3 所示。由图3 可知,两个核桃品种的根、枝、青皮中的主要酚类物质均为胡桃醌,其根和青皮中的胡桃醌含量均占90%以上,而其它器官中的含量仅占10%左右;其枝中的胡桃醌含量占55.21%~64.58%,同时还含有一定量的绿原酸、芦丁和杨梅素,其含量占比为5.97%~17.15%。叶片中的酚类物质以绿原酸和芦丁为主,‘黔核6 号’叶片中绿原酸和芦丁的含量占比分别为35.10%与45.23%,‘黔核7 号’叶片中绿原酸和芦丁的含量占比分别为20.76%与53.51%;同时,两个品种的叶片中均含有阿魏酸、儿茶素、槲皮素、杨梅素、胡桃醌等组分,其含量占比为2.13%~9.83%。内种皮中芦丁的含量占比为86.35%~94.03%,芦丁是其内种皮中的主要多酚物质,而没食子酸、丁香酸、儿茶素等组分的含量占比仅在1%左右。去皮种仁中的多酚物质以没食子酸、儿茶素、芦丁和槲皮素为主,其含量占比为12.77%~37.18%。

图3 两个核桃品种不同器官中酚类物质的含量分布情况Fig.3 Distribution of phenols content in different organs of two J.sigillata varieties

2.5 不同酚类物质的含量分布情况

两个核桃品种不同类别多酚物质的含量分布情况如图4 所示。由图4 可知,酚酸类物质主要存在于核桃叶片和内种皮中,其在‘黔核6 号’叶片和内种皮中的含量占比分别为59.78%与17.39%,其中以叶片中的含量为主;其在‘黔核7号’叶片和内种皮中的含量占比分别为37.65%与45.67%,其中以内种皮的含量为主。黄酮类物质主要存在于核桃内种皮中,其在‘黔核6 号’和‘黔核7 号’内种皮中的含量占比分别为74.90%与71.78%;而其在两个核桃品种叶片中的含量占比为17.59%~19.96%,其在两个核桃品种根和枝中的含量占比均为3.01%~4.91%,而在两个核桃品种青皮和去皮种仁中的含量占比均仅有0.19%~0.56%。萘醌类物质主要分布在核桃的根、枝、青皮之中,其在根中的含量最高,占比为67.04%~72.42%;其次是青皮中的含量,其占比为17.84%~24.07%;而其在枝中的含量占比仅有7.61%~7.66%,在叶片中的含量占比也仅有1.23%~2.13%。

3 讨论与结论

在对植物抗氧化能力的研究中发现,总酚、总黄酮含量的高低与植物抗氧化能力的强弱有关,这在一定程度上可以反映植物体内酚类物质的总体状况[20-22]。‘黔核6 号’与‘黔核7 号’不同器官中总酚、总黄酮的含量分布一致,不同器官间其含量差异均明显,两个核桃品种的总体表现均为内种皮>叶>枝>根>青皮>去皮种仁。这与张鹏飞等[23]对其果实中青皮、内种皮和去皮种仁总酚含量的测定结果一致。相关研究结果都表明,核桃内种皮中的酚类物质含量最高,说明核桃中的多酚物质多积累于其内种皮之中。

检测中发现,相同器官中多酚的组分基本相同,但两个品种间略有差异。从‘黔核6 号’与‘黔核7 号’的根、枝、叶、内种皮中均检测出相同组分,但只有从其青皮和去皮种仁中检测到的结果存在差异;在去皮种仁中,‘黔核7 号’比‘黔核6 号’多检测出对香豆酸;而在青皮中,‘黔核7 号’比‘黔核6 号’多检测出香草酸和表儿茶素这两种组分。不同器官间多酚组分的差异较大,从叶片和青皮中可检测到12 种单体酚,而从去皮种仁中只检测到7 种单体酚;只有没食子酸、对香豆酸、咖啡酸、丁香酸、芦丁这5 种单体酚在所有器官中均可检出,而香草酸仅在‘黔核7 号’的青皮中检出。此次未检出鞣花酸,这一结果与Regueiro 等[14]、Bhargava 等[24]在普通核桃和黑核桃中检出较高含量的鞣花酸及其衍生物的研究结果有所不同,这可能与不同核桃类型、地域环境等因素均有关。酚类组分差异还与核桃品种和器官分布有关。Akbari 等[25]在6 个不同核桃品种中发现,咖啡酸只存在于‘Kanikareh1’‘Kanikareh2’ ‘Birgholi1’‘Birgholi2’中,而‘Gerdakaneh1’和‘Kanikareh3’中均未检测到咖啡酸;其中,在‘Kanikareh1’的内种皮中同时检出丹宁酸、8-羟基喹啉、水杨酸、咖啡酸这4 种单体酚,而在去皮种仁中只测到咖啡酸;且只在‘Kanikareh2’的内种皮中检出香草酸,而在其它器官中均未检出,这与只在‘黔核7 号’青皮中测到香草酸的结果类似,这可能是不同品种和器官特异表达的结果。

图4 两个核桃品种不同类别多酚物质的含量分布情况Fig.4 Distribution of different kinds of polyphenols in two J.sigillata varieties

核桃多酚物质具有明显的器官特异性,根、枝、青皮均有较高含量的胡桃醌,其在‘黔核 6 号’和‘黔核7 号’不同器官中的含量顺序均为根>青皮>枝,是根、枝、青皮中的主要多酚物质。在枝、叶片和内种皮中还发现有较高含量的绿原酸,绿原酸在‘黔核7 号’和‘黔核6 号’叶片中的含量分别为734.5、1 757.1 μg·g-1,这与Cheniany等[26]、Gutiérrez-ortiz 等[27]报道的结果相似。此外,从两个品种的各个器官中均检测到较高含量的芦丁,其中,‘黔核7 号’和‘黔核6 号’叶片中的芦丁含量分别为1 893.4 与2 264.4 μg·g-1, 这一结果与Cosmulescu 等[28]测得的9 个核桃品种叶片中的芦丁含量平均为989 μg·g-1,其中,‘Vina’‘Hartley’‘Valcor’叶片中的芦丁含量分别为1 502、1 539、1 867 μg·g-1的研究结果一致。内种皮中的芦丁含量最高,‘黔核7 号’和‘黔核6 号’内种皮中的芦丁含量分别为8 092.1 与 12 636.2 μg·g-1。万政敏等[15]、曲清莉等[29]也都在内种皮中检测到了高含量的芦丁,这些研究结果进一步证明,核桃中富含芦丁,且其主要富集于内种皮上。

本研究从泡核桃的根、枝、叶、果实(青皮、内种皮、去皮种仁)中检测核桃多酚,共检测到14 种多酚物质,绿原酸、芦丁和胡桃醌是核桃中的主要酚类物质。不同器官多酚的组分及含量差异均明显,内种皮是多酚物质富集程度最高的器官。多酚物质具有明显的器官特异性,根、枝、青皮中的胡桃醌含量最高,其适合用以提取胡桃醌;叶片和内种皮中均含有丰富的酚酸和黄酮类物质,其中内种皮中芦丁的含量最高,其可作为提取芦丁的最佳器官。此外,核桃酚类物质的组分众多,仅用液相色谱分析会存在一定的局限性,可进一步使用液质联用(LC-MS)、气质联用(GC-MS)、核磁共振联用质谱(NMR-MS)等更先进的联用技术探析酚类物质的分布状况[30-31]。同时,还应关注果实发育过程中多酚物质的合成与积累,从相关基因克隆与表达、酶活等分子水平上研究其代谢途径和调控机理,从而为核桃多酚的研究提供更多的信息。

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