桃果实缝合线部位软化相关基因PpPME48的克隆与分析

刘璐琪，石天磊，申艳红，武军凯，王海静，张立彬

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066000)

桃(Prunuspersica(L.)Batsch)原产中国，是蔷薇科中重要果树之一，也是中国最古老的经济果树之一，在我国栽培历史悠久，种植面积大，分布广泛[1]。但是，桃果实采后迅速软化、腐烂变质，影响其销售与贮运[2]。尤其是有些桃品种出现缝合线处局部变软的现象，严重影响经济效益，若提前采摘又会影响果实品质。果实软化过程中质地的变化主要是果胶降解导致细胞壁的降解，同时也与纤维素和半纤维素的结构变化有关[3]。其中，果胶甲酯酶(pectin methylesterase，PME)在果实软化中起着关键作用，它主要存在于高等植物以及一些细胞壁降解的微生物中，属于水解酶类，是一种糖蛋白，能水解水溶性果胶分子中甲氧基(-OCH2)与半乳糖醛酸之间的酯键，从而形成果胶酸和甲醇，再经过PG(Polygalacturonase)作用形成游离的半乳糖醛酸[4,5]。目前，在番茄[6]、菠萝蜜[7]、柑橘[8]、树莓[9]、杏[10]和樱桃番茄[11]等果实中都已证明PME对果实软化的作用。同时许多研究表明，一些PMEs基因表达不受空间、时间的影响，在植株的整个生命历程中均持续表达[12]，另一些则只在根发育时期、茎伸长时期、果实成熟时期或花芽和花粉管等器官组织中特异性表达[13～16]。为探讨PpPME48基因与桃果实缝合线部位软化的相关性，笔者试验克隆桃PpPME48基因并分析其在不同品种、不同部位中的表达特性，旨在为研究PpPME48基因在桃软化方面的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本课题组发现抚宁区代庄村的北京2号突变体枝条所结果实比野生型枝条所结果实晚熟，且缝合线处果肉易变软。各取3个果，切取其缝合线和对应果面的果肉，取样后用液氮快速冷冻，置-80 ℃保存。共得到4个样品：分别记为WSP(野生型缝合线果肉)、WP(野生型果面果肉)、MSP(突变体缝合线果肉)、MP(突变体果面果肉)，送广州基迪奥生物公司进行转录组测序。

采用桃品种燕红和晚久保进行验证，燕红缝合线处易变软，晚久保缝合线处不易变软。这2个桃品种采摘于秦皇岛市昌黎县两山乡种植园，在果实八成熟时，采收大小一致，无病虫害的果实置于25 ℃室温下贮藏。在采收后当天、第3天、第5天选取3个果实分别切取缝合线和果面部位果肉，分别切碎混匀，于液氮中迅速冷冻，置-80 ℃低温保存。燕红与晚久保共获得以下12份样品：LF1与WF1，LF2与WF2，LF3与WF3，分别为燕红与晚久保采收当天、第3天与第5天缝合线果肉；LG1与WG1，LG2与WG2，LG3与WG3，分别为采收当天、第3天与第5天果面果肉。这些样品用于RNA的提取及荧光定量PCR进行基因表达定量分析。

1.2 方法

1.2.1桃PpPME48基因的克隆 按照植物RNA提取试剂盒(博迈德生物)说明书提取燕红果肉总RNA，使用超微量分光光度计(BioDrop)检测浓度，使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按照Invitrogen GenRacerTMKit试剂盒说明书进行反转录，以桃果肉RNA(1 000 ng)为模板得到双链 cDNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。

在测得的桃转录组数据中检测到PME基因家族17个基因成员，在桃基因组中找到PpPME48基因序列，利用DNAMAN软件在该序列两端设计一对引物，PME48-F：5′-CCCTTCCCATCCATCAATC-3′；PME48-R：5′-CTGCAGAACCGGC TTTGTTA-3′。由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成引物。以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为20 μL：10×ExBuffer：2 μL，dNTP：1.5 μL，ExTaq酶：0.1 μL，cDNA：1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O：14.4 μL。扩增程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循环34次，72 ℃延伸10 min。反应结束后用质量浓度为12.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，采用琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化目的条带，回收产物与PMD19-T vector载体连接，转化Super DH5α感受态细胞，将转化产物均匀涂到加氨苄青霉素的LB培养基上，培养14 h，挑取单菌落进行菌液PCR验证，随机挑选3个阳性克隆进行测序。

1.2.2生物信息学分析 利用DNAMAN软件进行蛋白质翻译和同源序列分析，利用NCBI Blastp搜索同源基因和蛋白序列；利用MEGA 5.10软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建分子进化树；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)等在线工具进行氨基酸基本理化性质、信号肽、跨膜结构预测；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)网站对蛋白的保守结构域进行预测；利用Cell-PLoc2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在线进行亚细胞定位预测;利用SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)分别进行蛋白质二级结构和三级结构分析。

1.2.3桃PpPME48基因的表达分析 利用DNAMAN软件在PpPME48基因的非保守区设计实时荧光定量引物，RT-PME48-F:5′-CACTCTGAGCGCGACAAG-3′；RT-PME48-R:5′-CCGATGAAGAAGCAAAGCC-3′。引物合成由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成。提取采后不同时期燕红和晚久保缝合线及果面部位的果肉RNA，分别将其逆转录为cDNA，然后以稀释1倍的cDNA作为RT-qPCR的模板，使用购自美国伯乐(Bio-Rad)有限公司的Bio-Rad CF CONNECTTMReal-Time System荧光定量PCR仪检测基因的表达量。参考佟兆国[17]筛选的桃内参基因TEF2设计荧光定量PCR引物，TEF2-F：5′-GGTGTGACGATGAAGAGTGATG-3′；TEF2-R：5′-TGAAGGAGAGGGA AGGTGAAAG-3′。RT-qPCR反应体系为10 μL体系：SYBR Mix：5 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA：1 μL，ddH2O：2 μL。两步法扩增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，39次循环。采用相对定量2-ΔΔCt法[18]进行3次生物学重复测定，然后利用Excel软件对实验结果统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

分别提取燕红和晚久保在采后当天、第3天和第5天的缝合线和果面处果肉提取RNA，超微量分光光度计(BioDrop)检测OD260/OD280比值均在2.0以上，表明提取的RNA无降解，质量浓度为10.0 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测如图1，RNA条带清晰无弥散，28 s RNA条带亮度约为18 s RNA条带的2倍，检测结果说明所提RNA质量良好可以进行后续试验。

2.2 桃PpPME48基因的筛选和克隆

将从实验室已完成的桃转录组测序数据库筛选出15个差异表达基因进行荧光定量PCR验证(图2)。15个差异基因的表达趋势均与转录组数据一致，这证明了转录组数据的可靠性。从转录组数据库中检测到24个的PME基因，表达量见表1，删除部分部位表达量为0的基因，剩下17个PME基因进行热图分析，结果发现，其中基因PpPME48在野生型缝合线(WSP)表达量高于野生型果面(WP)(图3)，同时突变体缝合线(MSP)表达量也远高于突变体果肉(MP)中的表达量，在突变体中MSP和MP之间相差倍数高达13倍，因此选择该基因为桃软化相关的候选基因并做进一步研究。

以燕红果肉cDNA为模板，PME48-F和PME48-R为引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带在1 000 bp以上，与预期目的基因大小一致(图4)。用胶回收试剂盒回收目的条带，将回收产物和PMD19T载体连接，经转化后，挑取单克隆菌落8个，进行菌液PCR检测，有7个菌落扩增出特异性条带且条带大小约1 200 bp，PpPME48基因的克隆阳性率达到87%，在阳性克隆中随机挑选3个送中美泰和公司进行测序。测序长1 278 bp，与已知差异片段重叠，发现有4个碱基差异。将其命名为PpPME48，GenBank登录号为MT019687。

表1 PME基因表达量

图2 RT-qPCR转录组数据验证

图3 桃果实转录组中PME热图分析

图4 PpPME48基因的PCR扩增产物(M:DL2000)

2.3 桃PpPME48基因编码的蛋白结构分析

桃PpPME48基因编码370个氨基酸。通过ProtParam分析可知，桃PpPME48蛋白质分子量为41 187.06 ku，分子式C1 856H2 860N500O533S15，理论等电点为8.79，PpPME48蛋白总的负电荷残基数(Asp+Glu)为37个，正电荷残基数(Arg+Lys)为43个。该蛋白由20种氨基酸构成，其中丙氨酸所占比例最大(8.1%)，半胱氨酸所占比例最小(1.4%)。该蛋白脂肪系数为77.76，不稳定指数为31.59，为稳定蛋白；该蛋白亲水性平均系数(GRAVY)为-0.158，属亲水性蛋白。信号肽预测发现PpPME48蛋白有1个信号肽，为分泌蛋白，裂解位点的位置在27和28之间。利用TMHMM在线分析结果表明，桃PpPME48蛋白不具有跨膜结构。使用Prot Comp 9.0在线软件进行亚细胞定位预测分析可知，桃PpPME48蛋白主要位于细胞外基质。利用SMART对其编码蛋白的保守结构域进行分析，表明PpPME48蛋白包含1个果胶甲酯酶结构域，位于氨基酸的75～361位点。

用SOPMA对PpPME48蛋白进行二级结构预测，其中包括21.62%的α-螺旋、6.76%的β-转角、30.81%的延伸链和40.81%的无规则卷曲，且其中所占比例最高的为无规则卷曲。通过SWISS-MODEL在线分析工具进行三级结构预测，结果见图5。可以看出，与二级结构预测的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构相符。

2.4 桃PpPME48基因同源分析与系统进化分析

通过BlastP比对发现PpPME48基因编码的氨基酸序列与扁桃(Prunusdulcis)、乌梅(Prunusmume)、甜樱桃(Prunusavium)、苹果(Malusdomestica)具有很高的同源性，序列相似程度最高，相似率分别为98.11%，96.22%，94.86%，82.79%。利用DNAMAN软件进行同源比对，结果显示，桃PME蛋白与其他物种PME蛋白具有相似结构域(图6)，包括5个高度保守区：RegionⅠ(GxYxE)，RegionⅡ(QAVAxR)，RegionⅢ(QDTL)，RegionⅣ(Gxx DFIFG)，RegionⅤ(YLGRxWx)。利用MEGA5.1进行系统谱系分析发现，PpPME48与蔷薇科的扁桃、乌梅和甜樱桃亲缘关系较近(图7)。

注：红框区域表示5个保守的结构域

图7 PpPME48蛋白的系统进化树分析

图8 PpPME48基因的表达分析

2.5 桃PpPME48基因在不同品种不同贮藏时间的表达分析

燕红是缝合线易变软品种，晚久保是缝合线不易软品种。随着果实后熟，PpPME48基因在2个品种的缝合线和果肉部位的表达趋势都是先升高后降低，在采收后第3天表达量达到最高(图8)。然而在燕红中，PpPME48基因在缝合线处的表达量明显高于果面，且在采后各时期、部位的表达亦明显高于晚久保，这说明燕红的缝合线变软可能与PpPME48基因的高表达相关。

3 结论与讨论

果实软化是果实成熟标志之一，同时是一个复杂的生长发育调控过程，果实在储藏过程中仍然不断软化。许多研究表明，果实软化与果胶甲酯酶(PME)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、纤维素酶(Cellulases，CX)等密切相关，其中果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶的活性增强导致果胶等细胞壁物质降解，从而引起果实硬度下降、质地变软。果胶甲酯酶抑制剂(Pectin methylesterase inhibitors，PMEI)抑制果胶甲酯酶去甲酯化作用，从而调控PME的活性。曾文芳等[19]在溶质型桃和硬质型桃果实成熟过程中发现1个PME和2个PMEI基因在溶质型桃中高表达，是研究桃果实成熟软化的关键基因。Xue等[20]在草莓研究中发现，FvPME38和FvPME39在果实成熟过程中大量表达导致草莓软化，并加速果实成熟进程。Tieman等[21]在研究番茄中发现，PME对果实软化影响显著，但是不影响果实成熟进程。因此，不同植物的PME表现不同功能，可能是果实发育过程的多样性导致。同时，许多研究表明，PME的活性在不同种类、不同品种的果实中表现不同，起着不同作用。在苹果中，魏建梅等[22]发现，在果实软化过程中，PME的活性逐渐增加，且在不同时期不同品种中存在差异，受乙烯调控的影响。在杏中，Botondi等[23]发现，品种Ceccona中果胶甲基酯酶(PME)活性均呈下降趋势，果实成熟过程中硬度不变；而在品种San Castrese中，PME活性略有升高，果实在成熟过程中变软。在茄子中，赵云峰等[24]研究发现，采后果肉PME活性呈峰型变化。

果胶甲酯酶是一个庞大的基因家族，在植物中检测到多种PME同工异构体，它们的分子量、等电点和生物化学活性都不相同[25]。霍如雪等[26]在桃PME基因家族中鉴定出69个PME蛋白，按照基因和蛋白的结构分为TypeⅠ，TypeⅡ两类。Type Ⅱ类PME蛋白具有1个比较长的N-端PRO区域，而TypeⅠ类PME蛋白的PRO区域很短甚至缺失，PpPME48具有1个比较长的PRO区域，属于TypeⅡ。PpPME48全长1 113 bp，共编码370个氨基酸，蛋白质分子量为41 187.06 ku，理论等电点为8.79，翻译后的蛋白序列含有果胶甲酯酶的重要结构域，与扁桃(Prunusdulcis)、乌梅(Prunusmume)、甜樱桃(Prunusavium)的PME蛋白有很高的同源性。PpPME48在北京2号桃突变体缝合线部位的表达量是其果面部位表达量的13倍，说明该基因可能参与了缝合线部位的变软。RT-qPCR分析表明，PpPME48基因在缝合线易软品种中表达量显著高于不易软品种，且在易软品种燕红中，PpPME48在缝合线处的表达量显著高于果面，与转录组结果相符。由此可知，PpPME48基因在桃果实软化过程中起重要作用，并且与缝合线部位的软化密切相关。