柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心肌细胞Bcl-2及Fas表达的影响∗

刘建和 毛宗裕 肖冰凌 袁恒佑 杨成龙 赵吉锐

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410007；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

根据《中国心血管病报告2018》，随着经济发展，生活质量及饮食水平提高，中国心血管疾病发病率及死亡率不断增长，防治心血管疾病十分迫切[1]。各种类型的心肌缺血均可引起心律失常，而钙离子（Ca2+）的转运障碍是其发病的重要机制之一。缺血性心律失常与心肌细胞凋亡相互影响，心肌出现损伤，可能机制为钙超载、氧化应激。已了解心肌细胞凋亡与心血管疾病的发病机制相关[2-3]，Bcl-2及Fas是心肌凋亡中重要的基因。本研究旨在运用依据“和解定悸法”所研制的柴胡三参胶囊，与维拉帕米及参松养心胶囊做对照[4-5]，观察柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠模型心肌细胞Bcl-2蛋白及Fas蛋白的影响[6-7]，探索柴胡三参胶囊抗心肌凋亡的作用，完善其治疗缺血性心律失常的可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8周龄的Wistar大鼠60只，SPF级，雄性，体质量（200±20）g。动物购自长沙天勤，许可证号为SCXK（湘）2014-0011，实验动物质量合格证号No.43006700015330。动物均在实验前置于实验室适应环境3 d，在清洁及安静环境下分笼饲养，每笼5只。喂养饲料购自湖南中医药大学东塘实验动物中心。室温控制在（23±3）℃。将60只大鼠按随机数字表法随机分成6组，为假手术组、模型组、柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组、维拉帕米组、空白组，每组10只。

1.2 药物与试剂

1）药物。柴胡三参胶囊（组成为柴胡、黄芩、法半夏、党参、丹参、苦参、青蒿、甘草，为医院自制剂，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科提供，批号140403。规格每粒0.4 g）；参松养心胶囊（北京以岭药业有限公司生产，批号Z20103032；规格每粒0.4 g）；维拉帕米片剂（天津市中央药业股份有限公司生产，批号H12020051；规格每片0.04 g）。柴胡三参胶囊、参松养心、维拉帕米均以70 kg成人剂量0.069 g/（kg·d）换算，将胶囊溶水后制成灌胃液。2）试剂。10%水合氯醛（上海展云，货号180920）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（bioswamp，货号PAB180007）；RIPA（强）组织细胞快速裂解液（bioswamp，货号 PAB180006）；蛋白质Marker（Thermo，货号26634）；RNA保存液（北京华越洋，货号ZH0103-A）；ProteinG Magnetic Beads（CellSig⁃naling，货号 9006S）；过硫酸铵（自 Sigma，货 号A6761）；Tween-20（Amresco，货号 P-1379）；十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma，货号151-21-3）；TEMED（Sigma，货号 110-18-9）；PBS磷酸盐缓冲液（bio⁃swamp，货号PAB180003）；PVDF转移膜（millipore，货号IPVH00010）；化学发光试剂（millipore，货号 WB⁃KLS0010）。Western blotting溶液配制：（1）PBS溶液：在 600 mL的 ddH2O 中溶解 NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g和 KH2PO40.24 g，用 HCl将 pH 调至7.4，定容至1 L，过滤后高压灭菌，室温封存。（2）1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）：将3.09 g DTT溶于20.0 mL 0.01 mol/L pH5.2的乙酸钠中，经过滤及除菌后分为1.0 mL/份，于-20℃保存。（3）30%丙烯酰胺：29.0 g丙烯酰胺和1.0 g甲叉双丙烯酰胺配以70 mL ddH2O搅拌加热溶解后，定容至100 mL，4℃避光存放。（4）10%过硫酸铵：0.5 g过硫酸铵溶于5 mL ddH2O中，4℃保存。（5）1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Trisbase 36.33 g 溶于ddH2O中，用浓盐酸调pH值至8.8，定容至200 mL。（6）1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Trisbase 24.22 g 溶于ddH2O中，用浓盐酸调pH值至6.8，定容至200 mL。（7）1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Trisbase 3.03 g，甘氨酸14.4 g，10%SDS 10 mL，于ddH2O中溶解，定容至1 L。（8）2×SDS加样缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）2%SDS，0.016%溴酚蓝，及20%甘油。（9）电转缓冲液：甘氨酸14.4 g，Tris⁃base 3.0 g，甲醇200 mL，加ddH2O定容至1 L。（10）TBS（pH8.0）：在 95 mL ddH2O 中加入 Tris-base 1.21 g，NaCl 8.77 g，溶解并调pH至8.0后，定容至1 L。（11）PBST：含0.05%Tween-20的 PBS。（12）封闭液：含 5%脱脂奶的PBST。

1.3 实验仪器

电泳仪（BIO-RAD，型号miniprotean3cell）；酶标仪（芬兰雷勃，型号MK3）；干式恒温器（杭州爽盛，型号K30）；离心机（德国Eppendorf，型号Centrifuge5424R）；微量移液枪（美国RaininPiPet-Lite）；全自动化学发光分析仪（上海天能，型号Tanon-5200）；水浴锅（Leica，型号HI1210）；UPT优普特实验室超纯水器[法国Mil⁃liPORE，型号ULUPURE]。

1.4 分组与造模

1）分组。将60只大鼠按随机数字表法随机分为6组：假手术组、模型组、柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组、维拉帕米组、空白组，每组10只。2）造模方法。用药物干预后进行造模。造模前禁食12 h，末次给药后30 min后进行造模，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉老鼠，固定于手术台，切开气管行气管插管，连接呼吸机，以大头针皮下接RM-6280生物信号采集系统（德国产），稳定5～10 min后记录一段正常心电图。于胸骨左缘纵行切开皮肤，切口长度约2 cm，逐层手术剪分离组织，剪断肋间肌肉，暴露出心脏，左心耳下进针，肺动脉旁出针，硅胶管结扎冠状动脉左前降支，关闭胸腔，立即观察ECG。以Ⅱ导联ST段明显抬高或T波高耸，结扎处心脏表面颜色变暗为造模成功的标准。结扎30 min后再灌注40 min，观察灌注后ECG的变化，再灌注成功的标志为ST段回落或T波下降，缺血区颜色转红。假手术组则不结扎硅胶管。

1.5 干预方法

干预2周，假手术组、模型组、空白组给予蒸馏水灌胃，灌胃容积为1 mL/100 g，其余实验组按分组药物灌胃。柴胡三参胶囊组：以70 kg成人剂量0.069 g/（kg·d）换算，剂量为0.432 g/（kg·d）。参松养心胶囊组：同柴胡三参胶囊组。维拉帕米组：换算后维拉帕米溶液0.022 g/（kg·d）。观察结束后处死老鼠，取下缺血心肌组织（大小约5 mm×5 mm）立刻放入装内RNA保存液的独立锥形试管中，做好标记，密闭封存于-80℃的冰箱中。

1.6 观察指标

1）心律失常指标：采用Curtis和Walker（1988）心律失常评分法对心律失常严重程度进行比较[8]。用RM-6280生物信号采集系统监测心电，记录Ⅱ导联，记录心律失常的发生例数及计算心律失常积分。2）Western blotting检测大鼠心肌细胞的Bcl-2蛋白及Fas蛋白表达变化。按照每20mg组织配150～250 μL裂解液的比例充分裂解，裂解后的样品在4℃，12 000g离心15 min，取上清液，完成蛋白质定量后封存于-80℃冰箱。在酶标板中加入蛋白标准液及去离子水，绘制标准曲线，根据样品的吸光值，可在标准曲线上获得相应的蛋白质量浓度（μg/μL），乘以样品稀释倍数（10）等于样品实际质量浓度（μg/μL）。备好SDSPAGE胶上样，每孔上样量为20 μg蛋白左右，电泳选一般浓缩胶80 V，40 min，分离胶120 V，50 min，适当调整电压和时间，当染料到达胶底部时停止电泳。选用湿转转膜行封闭及抗体孵育，一抗孵育过夜，二抗1︰10 000孵育过夜，运用ECL化学发光检测后全自动化学发光分析仪检测膜，TANONGIS软件读取各条带灰度值。β-actin作为内参对照。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较

各组大鼠前期灌胃阶段无自然死亡。造模阶段因手术创伤、未发现再灌注、出现恶性心律失常等，假手术组死亡2只，维拉帕米组死亡2只，其中室颤死亡1只，柴胡三参胶囊组室颤死亡1只，模型组室颤死亡4只，死亡共9只，采集51份标本。

2.2 各组大鼠心电图变化

2.2.1 各组大鼠心电图表现 见表1。恶性心律失常死亡大鼠进入心律失常评分统计，通过RM-6280生物信号采集系统采集有效大鼠心电图57份。根据Cur⁃tis-Walker心律失常评分标准进行计算：正常心电图0分，房性心律失常1分，室性早搏2分，室性心动过速3分，室颤4分。

表1 各组大鼠心电图汇总统计表（n）

2.2.2 各组大鼠心律失常平均积分比较 见表2。与空白组比较，假手术组心律失常发生率增加，但差异无明显统计学意义（P＞0.05）；在心肌缺血后的心律失常的发生率极高，模型组心律失常积分明显升高（P＜0.05），提示缺血性心律失常模型造模成功。与模型组比较，3个药物干预组心律失常评分下降，差异有统计学意义（P＜0.05），提示药物干预有效。与柴胡三参胶囊组对比，参松养心胶囊组差异无统计学意义（P＞0.05），维拉帕米组差异有统计学意义（P＜0.05），提示柴胡三参胶囊、参松养心胶囊干预抗缺血性心律失常效果优于维拉帕米。

2.3 各组大鼠心肌细胞中Bcl-2蛋白表达比较

表2 各组大鼠心律失常平均积分比较（分，±s）

表2 各组大鼠心律失常平均积分比较（分，±s）

与空白组比较，※P＜0.05；与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01。与柴胡三参胶囊组比较，▲P＜0.05。下同

组 别n 心律失常积分柴胡三参胶囊组参松养心胶囊组维拉帕米组模型组假手术组空白组10 10 9 10 8 10 1.70±0.67★1.70±0.82★*2.11±1.05★▲3.20±0.79※0.50±0.76 0.00±0.00

见表3。各药物干预组与模型组进行比较，模型组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平相对降低，维拉帕米组Bcl-2蛋白升高相对较明显，柴胡三参胶囊组及参松养心胶囊组均可上调心肌凋亡蛋白Bcl-2的表达，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组、维拉帕米组3个药物干预组组间进行对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠心肌细胞中Fas蛋白表达比较

表3 各组大鼠缺血心肌细胞中Bcl-2蛋白表达的比较（±s）

表3 各组大鼠缺血心肌细胞中Bcl-2蛋白表达的比较（±s）

组别柴胡三参胶囊组参松养心胶囊组维拉帕米组模型组假手术组空白组n 10 10 9 10 8 10 Bcl-2蛋白表达0.53±0.11★★0.54±0.11★★0.58±0.10★★0.32±0.13 0.68±0.14 0.72±0.12

见表4。取平均灰度值，模型组大鼠心肌细胞Fas的表达升高。与模型组比较，柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组、维拉帕米组Fas的表达水平均不同程度降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组之间差异不明显（P＞0.05）。

综上，模型组Bcl-2蛋白下降而Fas蛋白升高，提示缺血性心律失常后出现心肌凋亡，柴胡三参胶囊组、参松养心胶囊组、维拉帕米组均可上调Bcl-2蛋白表达，下调Fas蛋白，均可抗缺血性心律失常心肌凋亡，三者减少心肌损伤的效果无明显差异。

表4 各组大鼠心肌细胞中Fas蛋白表达的比较（±s）

表4 各组大鼠心肌细胞中Fas蛋白表达的比较（±s）

组别柴胡三参胶囊组参松养心胶囊组维拉帕米组模型组假手术组空白组n 9 1 0 8 6 8 1 0 Fas蛋白表达0.43±0.07▲0.42±0.09▲0.35±0.07▲▲0.51±0.10 0.23±0.08 0.15±0.06

图1 各组Bcl-2及Fas蛋白表达条带

3 讨论

心律失常是心肌缺血的并发症，包括室早、室速和室颤等恶性心律失常，是心肌梗死患者早期死亡的主要原因[8]。柴胡三参胶囊以“和解”之法组方，来源于和解定悸之柴胡三参汤，是基于小柴胡汤的方药，主要以和解少阳为基础，从寒温并用，疏达上下，通利三焦，交通内外，调理气机等多方面调和，体现“缓治致和”的精神。通过柴胡、黄芩、法半夏、党参、丹参、苦参、青蒿、甘草8味药，祛除痰热瘀结诸邪，兼顾扶补正气，得益气活血、清热化痰、和解定悸之功，原柴胡三参汤中药有常山，因常山有毒，改用青蒿，是治疗缺血性心律失常的有效验方[9-11]。

维拉帕米、参松养心胶囊是临床治疗心律失常的常用药物。维拉帕米作为钙离子拮抗剂，治疗缺血后心律失常作用确切，经实验证实可通过直接或间接上调Bcl-2表达保护心肌，改善心肌凋亡[12]。参松养心胶囊主要成分为人参、麦冬、山茱萸肉、丹参、酸枣仁（炒）、桑寄生、赤芍、土鳖虫、甘松、黄连、南五味子、龙骨，可益气养阴、活血通络、清心安神，用于治疗冠心病室性早搏属气阴两虚、心络瘀阻证型。参松养心胶囊也被实验证实用于大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，可减轻心律失常的程度，且有抗心肌凋亡的作用，故选为阳性对照组[13]，在实验中采用2周的药物疗程以达到稳定浓度获得干预效果。

缺血性心律失常涉及多种机制，是心肌组织缺血、缺氧后，诱导触发灶和致心律失常基质共同作用，心肌电生理异常而发生，可出现在再灌注之前或期间。细胞凋亡是细胞死亡的一种重要形式，它是由基因调控的、在一定条件及信号转导下程序性的主动细胞死亡过程。线粒体通路是细胞凋亡的主要通路，Bcl-2蛋白参与其中，可进行上游调控，抑制凋亡蛋白酶Caspases激活，维持膜通路稳定。Fas家族主要是细胞外源性凋亡蛋白，称为死亡受体，以跨膜转导凋亡信号，Fas及Fas配体结合诱导细胞凋亡[14]，与Bcl家族共存，两种蛋白共同参与心肌凋亡发展过程，提示抗凋亡作用及促凋亡作用的交争状态。细胞凋亡与心血管疾病的关系密切，各种细胞凋亡因子存在于心肌细胞中有着正向和负向的作用，参与了心肌缺血、心律失常、肥厚型心肌病、心力衰竭等众多心血管病的发生发展过程[15]。

心肌凋亡与缺血性心律失常相互影响，心肌再灌注损伤中，心肌凋亡时间越久，缺血面积越大，心律失常发生率越高。当长时间缺血的心肌细胞再灌注，氧自由基产生，炎性细胞浸润，血管内皮受损，心肌电活动不稳定，心肌细胞L型钙通道电流升高，Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度增加，发生钙超载，心肌细胞过度凋亡，抑制凋亡因子Bcl-2蛋白及刺激凋亡因子Fas蛋白表达水平相应变化，触发缺血性心律失常，在早期运用药物减少心肌细胞凋亡及缺血性心律失常的发生对于指导临床有一定意义。

现代中医药关于抗心肌细胞凋亡的研究颇多[16]，多种药物被证实对心肌凋亡过程中各通道有着不同作用。柴胡三参胶囊抗心律失常作用明确，但作用机制尚未不明确，此次选用心肌凋亡经典蛋白Bcl-2及Fas蛋白作为切入点观察柴胡三参胶囊抗心肌凋亡的作用，可为临床治疗用药提供更加有力的支持及解释。通过实验可知，柴胡三参胶囊能上调抑制凋亡因子Bcl-2的表达及下调促进凋亡因子Fas的表达，从不同渠道减轻心肌细胞凋亡，缓解心肌细胞损伤，保护心肌细胞，从细胞层面改善缺血性心律失常。