拟南芥RBS1基因RNAi载体构建及遗传转化子的筛选

孟飒飒，王胜楠，刘凌云

(河南大学生命科学学院 植物逆境生物学重点实验室，河南 开封 475004)

0 引言

与传统方法如反义核酸(antisense DNA/RNA)相比，RNAi技术在特异地沉默目的基因的表达上，更为高效和可靠.在最近发展的生物技术中，RNAi技术在植物辅助育种中作为遗传材料创建的精确而有力的工具被广泛使用[3].科学家们已经将RNAi技术应用于植物营养品质及特定性状的改良，包括高产、抗病、抗虫及花形、花色等方面的研究[4，5].

1 材料和方法

1.1 实验材料

拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)野生型(Col-0生态型).

菌株及质粒载体：E.coli菌株DH5α，农杆菌菌株GV3101，双元质粒载体pFGC5941由美国Arizona大学The Plant Chromatin Database构建并提供.

主要试剂：利福平、卡那霉素、除草剂Basta购自Sigma公司，限制性内切酶XmaI、XbaI、XhoI、NcoI购自NEB公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA连接试剂盒购自TAKARA公司，KOD高保真酶购自TOYOBO公司，其他生化试剂盒药品使用国产分析纯或进口分装.实验所用引物由北京金维智公司合成.

1.2 试验方法

1.2.1 拟南芥的种植

取适量干燥饱满的拟南芥种子，加入0.1%升汞，表面消毒5 min，用无菌水反复洗涤5～6次，将种子点播于0.6% MS培养基中，4 ℃处理2～3 d，将种子置于培养间培养(光/暗周期为8/16 h，温度18～22 ℃，光照强度120 μmol/(m2·s)，相对湿度80%)，生长约2周后，移植至土中(营养土∶蛭石=1∶1)进行培养，10～12周即可收获种子.

1.2.2 拟南芥总RNA的提取及cDNA的合成

拟南芥幼苗总RNA的提取及cDNA的合成参考文献[8]的方法进行.

1.2.3 PCR产物的检测和载体的构建

1.2.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化及转基因苗的筛选

采用热激法将重组质粒pFGC5941-RBS1S及pFGC5941-RBS1C分别导入农杆菌GV3101感受态细胞，涂板筛选，挑选单菌落摇菌，用菌液PCR检测目的基因的存在.拟南芥农杆菌转化采用花序侵染法[10].将农杆菌侵染后收获的种子通过Basta除草剂抗性筛选获取转基因阳性苗.

2 结果与分析

2.1 RBS1蛋白质氨基酸序列保守性分析

为了构建RBS1基因的敲除突变体，首先利用Clustal W软件对RBS1蛋白的氨基酸序列保守性进行分析.发现RBS1蛋白具有非常保守的基序GEXXQGFXRXXAXXG(图1)，同时RBS1与同家族RBS2及RBS3蛋白的同源性比较近，分别达到76.85%和77.75%，而和RBS4的同源关系比较远，同源性仅为19.18%.根据生物信息学分析的结果，确定RBS1特异序列为一段从59～200的氨基酸的序列，所对应的基因编码序列长度为367 bp；同时发现RBS1保守序列为从210～370的氨基酸序列，且该保守序列中包含高度保守的GEXXQGFXRXXAXXG基序，其对应的基因编码序列长度为411 bp.分析得到的特异序列及保守序列分别作为构建RBS1基因敲除突变体的参考序列.

图1 RBS1蛋白质氨基酸序列保守性分析

2.2 RBS1基因序列特异区RNAi载体pFGC5941-RBS1S的构建

为获得RBS1基因敲除同时又不影响同家族其他基因表达的RNAi转基因植株，本实验首先以野生型拟南芥cDNA为模板，以引物SF和SR扩增RBS1特异片段S，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在接近367 bp处有明显亮带，其大小与预期的RBS1特异区片段一致(图2A)，切胶回收.将回收的目的片段和pFGC5941空载体分别用XmaI和XbaI限制性内切酶双酶切，双酶切产物跑胶、回收，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接，热激转化E.coliDH5α，涂卡那抗生素平板，37 ℃过夜培养，取边缘整齐透亮的菌落，扩菌落PCR，取阳性菌落摇菌，提取重组质粒，质粒PCR，双酶切验证，发现插入基因片段S与重组质粒PCR扩增片段大小一致(图2B)，此时S片段反向连入pFGC5941载体，命名为pFGC5941-RBS1.之后再次用SF及SR引物重新扩增RBS1特异片段S，将PCR产物跑胶回收后，和以上构建的重组质粒pFGC5941-RBS1分别用XhoI和NcoI限制性内切酶双酶切，跑胶，切胶回收，T4 DNA连接酶16℃过夜酶连，涂平板培养，挑选单菌落摇菌提质粒，质粒双酶切验证证实S片段正向S片段正向连入载体pFGC5941-RBS1中(图2C)，此重组载体命名为pFGC5941-RBS1S(由于是第二次酶切，该重组载体本身含有目的片段，质粒PCR检测不能说明问题，因此仅用双酶切检验).经两次双酶切及连接将RBS1特异片段S，正反向重复连进载体pFGC5941.将测序正确的pFGC5941-RBS1S-RNAi重组载体转化农杆菌，农杆菌菌落PCR(图2D)，选阳性菌落摇菌按照1.2.2的方法转化野生型拟南芥植株.

A.RBS1基因特异序列(S)片段的克隆，1代表克隆的S片段；B.pFGC5941-RBS1载体的双酶切验证，泳道1代表重组载体的质粒PCR，泳道2代表重组载体的双酶切；C.pFGC5941-RBS1S载体的双酶切验证；D.构建成功RNAi载体转入农杆菌的鉴定，1代表菌落PCR结果.M代表Marker 2000.下同.

2.3 RBS1氨基酸序列保守区RNAi载体pFGC5941-RBS1C的构建

图3 RBS1基因保守序列RNAi载体的构建

虽然前期生物信息学分析结果显示RBS1与该家族其他基因同源性比较高，且保守区域可能为RBS1的功能区，为尽可能获取RBS1功能缺失突变体，本实验又构建了以RBS1保守区为靶序列的RNAi重组载体pFGC5941-RBS1C.构建具体过程与以RBS1特异区为靶序列的RNAi重组载体pFGC5941-RBS1S的构建过程类似(图3).同样将双酶切验证及测序均正确、确认RBS1保守区序列正反向重复插入的pFGC5941-RBS1C-RNAi重组载体转化农杆菌，农杆菌菌落PCR，选阳性菌落摇菌按照1.2.2的方法转化野生型拟南芥植株.

2.4 pFGC5941-RBS1-RNAi转基因植株的筛选

A.pFGC5941-RBS1S-RNAi转基因植株的筛选；B.筛选出转基因阳性植株的特写

将上述农杆菌介导的RNAi转基因植株T1代种子收获，干燥后撒播于营养土中，春化3天后，移至培养间培养.待幼苗长出两片子叶后即用35 mg/L的Basta进行喷洒筛选，非抗性苗经Basta喷洒后叶子变黄枯死，而筛选出的转基因阳性植株依然能够正常生长(图4).经过多次筛选初步得到以RBS1保守区为沉默靶序列的转基因植株125个株系，以RBS1特异区为沉默靶序列的转基因植株90个株系.将阳性转基因株系移植，单株收种子繁殖，为随后的RBS1基因功能检测打下基础.

3 讨论

基因过表达已经被用于分析基因功能，但这种方法不是对所有蛋白质都可行，而且结果难以解释.T-DNA插入或者EMS诱变导致的基因缺失可以阐释蛋白质的功能，但这些方法耗时、昂贵，而且可能导致胚胎致死表型，所以相比其他方法，RNAi技术提供了一种非常高效并且能阻止某个特异性基因表达的方法，具有更大的优势与潜力[11，12].

RNAi技术在研究植物基因功能时应用广泛[13-16].一般在基因沉默实验中，为了能特异沉默目的基因，往往选择蛋白特异序列作为沉默的靶序列.但很多时候，蛋白保守序列也往往是蛋白的功能域结构，因此试验中仅仅沉默基因特异序列未必能达到基因沉默的目的.本实验中，在拟南芥网站中未能查到RBS1基因的T-DNA插入突变体，生物信息学分析显示该基因主要在花药中表达[17]，这些结果暗示，该基因与植物育性有关，并且其功能缺失突变体可能致死，因此构建RNAi转基因株系以获取低水平表达突变体就成为研究该基因功能的理想工具.本实验中分别成功构建了旨在敲除RBS1特异序列和敲除RBS1保守序列的两个RNAi双元载体，确保达到敲低RBS1基因的目的.活性氧不仅调节植物生长和发育过程，而且也介导生物与非生物胁迫响应过程[18-20].本研究前期筛到rbs1是活性氧敏感突变体，因此，获得RNAi转基因植株后的下一步工作是评估所筛选阳性RNAi转基因植株的沉默效率，选择基因敲除植株检测活性氧相关表型，为以后深入研究RBS1的生物学功能和作用机制奠定基础.