双酶
- 鸡IL-2和IL-4融合基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性
和真核表达质粒的双酶切、回收与鉴定 按QuickCutEcoR I和QuickCutKpnI说明书，将pUC57-ChIL-4重组质粒和pCI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收pCI(约4 000 bp) 和ChIL-4的目的条带；同样方法双酶切与鉴定pUC57-ChIL-2和pCI，胶回收pCI与ChIL-2的目的条带。1.3.3 连接与转化 按DNA Ligation Kit说明书进行连接反应，双酶切后的pCI分别与IL-4和IL-2片段按摩尔比3∶1
中国兽医杂志 2022年4期2022-07-07
- 山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达
dⅢ和EcoRⅠ双酶切并进行胶回收，回收纯化后的IL-2基因与pVAX1载体利用T4连接酶进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，提取转化成功的单菌落质粒，进行PCR和双酶切鉴定，同时送往上海英潍捷基公司测序。1.5 山羊IL-2基因真核表达质粒转染MDBK细胞及鉴定抽提无内毒素pVAX1-IL-2质粒，利用Lipofatamiane 2000将pVAX1-IL-2质粒转染至培养MDBK细胞，转染相同剂量的pVAX1载体空载体对照组，正常细胞为空白对照组
吉林畜牧兽医 2022年1期2022-02-23
- 刚地弓形虫SRS29C截短型基因的克隆及原核表达质粒的构建
此后用Ⅰ和Ⅰ进行双酶切，双酶切反应体系如表3，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，将正确的克隆质粒送至测序公司进行基因序列测定。表3 双酶切反应体系 μL1.2.5 原核表达质粒的构建将原核表达载体质粒pET-28a（＋）和pET-32a (＋)以及测序正确的克隆质粒pEASY-Blunt- SRS29Ccut分别用Ⅰ和Ⅰ限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系见表3，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收pET-28a和pET-32a载体片段以及带有Ⅰ和Ⅰ
天津农学院学报 2021年3期2021-10-13
- 双荧光素酶报告基因系统验证Nlu-miRNA-8对Ccdc124的靶向调控
述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为40μL。PCR产物酶切体系：PCR产物20μL，10×H缓冲液4μL，BSA 4μL，XhoI限制性内切酶2μL，NotI限制性内切酶2μL，ddH2O 8μL，共40μL。反应程序为在37℃酶切4 h，随后进行回收纯化。1.2.4 psi-CHECK2双酶切处理 psi-CHECK2载体含有限制性内切酶XhoI和NotI酶切位点。用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系
湖北农业科学 2021年15期2021-09-01
- 转基因大穗小麦与受体小麦差异基因的初步研究
总DNA的限制性双酶切。取灭菌0.5 mL离心管，按照表1中所列配制反应液进行酶切反应，总体积为30 μL。37 ℃水浴锅中保育5 h，同时对作为对照的λDNA进行37 ℃保育2 h，BamHⅠ和HindⅢ双酶切。表1 不同植物材料基因组总DNA限制性双酶切反应液配制量表（2）酶切DNA的电泳分离及硝酸纤维素膜转印。酶切DNA的电泳分离：酶切后的DNA样品与Marker一起进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。酶切片段的原位变性及硝酸纤维素膜转印：
广东蚕业 2021年7期2021-08-26
- 香菇柄双酶同步糖化工艺优化
酶和糖化酶，设计双酶同步糖化制备香菇柄水解液，提高其还原糖含量，并采用单因素试验及响应面试验优化糖化工艺条件，以期得到无酸碱处理的高还原糖香菇柄水解液，为后续香菇柄酒等发酵食品的开发提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂香菇柄：市售；纤维素酶（酶活20 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；糖化酶（酶活50 000 U/g）：宁夏夏盛实业集团有限公司；酒石酸钾钠、硫酸铜、乙酸锌、亚铁氰化钾、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
中国酿造 2021年5期2021-06-04
- 部分扩增结合双片段连接法克隆系列截短基因突变体
R Ⅰ/SalⅠ双酶切插入pEGFP_C2载体(未发表数据)。为了降低克隆cyclinE及其截短基因的激酶活性缺失(kinase-deficient, KD)突变体[17]过程中重复扩增带来的随机突变风险，本研究利用OE-PCR扩增C2-cyclinE、C2-cyclinE_T1和C2-cyclinE_T2这3个原始质粒中含突变位点的一小段共有序列，再采用双片段连接法置换原始质粒中的对应序列以构建完整突变基因，以期对常规OE-PCR作适当改进，提供一种克隆
生物技术进展 2021年1期2021-01-27
- 携带IL-2/NK4双基因减毒沙门氏菌TPIN的遗传稳定性研究
体系1.2.4 双酶切鉴定 挑取待测菌落于10 mL LA和LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养10 h后，按质粒提取试剂盒操作提取质粒，测浓度后进行双酶切鉴定(表3)。表3 酶切体系取上述混合物于37 ℃水浴1 h后，取酶切产物进行电泳分析。1.2.5 TPIN转染HepG2细胞 挑取新鲜接种的TPIN和Ty21a初始代菌落分别接种于10 mL LA和10 mL LB液体培养基中，37 ℃恒温摇床培养OD600为0.6，离心，D-PBS洗涤
微生物学杂志 2020年3期2020-09-07
- 水稻OsWHY1基因克隆及过表达与RNAi载体构建
acⅠ与SpeⅠ双酶切正义链载体与PTCK303表达载体，回收片段后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒后用RS引物(表1)进行PCR验证.用KpnⅠ与BamHⅠ双酶切反义链载体与连接有正义链的PTCK303表达载体，回收片段后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，抽提质粒后用RAS引物(表1)进行PCR验证与SacⅠ与BamHⅠ双酶切验证.利用冻融法转化农杆菌EHA105，并进行菌落PCR鉴定，阳性菌液加入50%甘油于-80 ℃保存.2 结
湖北大学学报(自然科学版) 2020年4期2020-07-15
- 拟南芥RBS1基因RNAi载体构建及遗传转化子的筛选
aI限制性内切酶双酶切，双酶切产物跑胶、回收，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接，热激转化E.coliDH5α，涂卡那抗生素平板，37 ℃过夜培养，取边缘整齐透亮的菌落，扩菌落PCR，取阳性菌落摇菌，提取重组质粒，质粒PCR，双酶切验证，发现插入基因片段S与重组质粒PCR扩增片段大小一致(图2B)，此时S片段反向连入pFGC5941载体，命名为pFGC5941-RBS1.之后再次用SF及SR引物重新扩增RBS1特异片段S，将PCR产物跑胶回收后，和以上构建
辽宁大学学报（自然科学版） 2020年1期2020-07-03
- 扁果枸杞表皮蜡质合成相关基因LbCER1的RNAi载体构建
hoI/KpnI双酶切，回收小片段，同 T4连接酶与经同种限制性内切酶双酶切并回收大片段的载体pKANNIBAL连接，得到重组克隆pKANNIBAL-LbCER1(+)，转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞。以P3、P4为引物，进行菌落 PCR扩增检测阳性菌落。P3序列为5′-AGAAGACGTTCCAACCACG，P4序列为5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC。挑取阳性菌落测序验证pKANNIBAL-LbCER1(+)质粒构建的正确
食品与发酵工业 2020年10期2020-06-12
- 潜在抑癌基因eIF4E3野生型和突变体质粒的构建*
ES2-EGFP双酶切与纯化、回收：用限制性内切酶EcoRI、BamHI双酶切eIF4E3基因片段及空载质粒PIRES2-EGFP。用限制性内切酶NheI、BamHI分别双酶切eIF4E3C69a、eIF4E3W86a基因片段及空载质粒PIRES2-EGFP。将eIF4E3酶切产物进行回收；提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳，找到相应的目的条带切胶并回收。1.2.3 目的片段和载体质粒的连接和转化、提取、鉴定：使用T4 DNA Ligase产品将目的片段与线性载体
黑龙江医药 2020年4期2020-05-19
- 胶原三股螺旋重复蛋白1基因真核表达载体的构建及其与microRNA-30b关系初探
Ⅰ/Xho Ⅰ 双酶切，回收纯化，克隆至pIRES2-EGFP载体。1.4 载体构建 NheⅠ/XhoⅠ双酶切载体pIRES2-EGFP和1095 bp的CTHRC1 PCR产物(见1.3)，行1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，切胶回收载体及DNA片段。按照TakaRa DNA Ligation Kit Ver.2 .0试剂盒说明书配制连接体系, 将CTHRC1 DNA片段与pIRES2-EGFP真核表达载体进行连接。连接产物转化至DH5α E.coli C
临床肝胆病杂志 2020年2期2020-02-28
- 双荧光素酶报告法验证乳腺癌中lncRNA PVT1 为let-7c-5p的靶基因
baⅠ和NotⅠ双酶切，将双酶切产物进行电泳并回收。目的片段与载体质粒摩尔比7∶1，16℃连接过夜，将连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5α 中，涂布于含氨苄青霉素的LB 固体培养基，倒置培养12h，挑取单菌落进行摇床培养。12h 后收集菌体，提取质粒，进行XbaⅠ和NotⅠ双酶切验证，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.5 细胞转染及检测 MCF-7 细胞培养同1.2.3。提取对照质粒pGL3、重组质粒pRL-TK-Pw 和pRL
浙江医学 2020年1期2020-01-18
- 肺炎克雷伯菌产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的基因环境研究
2.1接合子质粒双酶切 对筛选出的含有CTX-M-14基因的阳性接合子用质粒小提试剂盒进行抽提，经0.8%琼脂糖电泳(溴化乙锭染色)，紫外投射仪下观察结果，确认接合子质粒存在后用BamHI和SalI双酶切。双酶切反应体积为25 μL，反应体系为接合子质粒7 μL，水8 μL，10×Buffer 4 μL，BamHI 3 μL，SalI 3 μL，混匀并离心，37 ℃水浴酶切3～4 h，经0.6%琼脂糖电泳(溴化乙锭染色)，用凝胶成像摄相。1.2.2.2PB
中国人兽共患病学报 2019年10期2019-11-05
- 申克孢子丝菌STE20基因RNA干扰菌株的构建方法
oⅠ和HindⅢ双酶切；将PUC-PUT用XhoⅠ和HindⅢ双酶切。酶切后再分别纯化回收。c.将酶切后的纯化PCR片段与酶切后纯化的PUC-PUT载体进行连接，连接为环形质粒得到PUC-PSUT(见图1)。d.将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，提质粒，测序验证[5]。酶切体系：PCR片段(50～100 ng/μL)5 μLXhoⅠ1 μLHindⅢ1 μL 10×buffer2 μLddH2O11 μLTotal 20μL酶切温度：37℃，时
中国真菌学杂志 2019年3期2019-07-10
- 肝片吸虫SAP-2蛋白的基因克隆、表达及其诊断潜力初步评估
-2基因的扩增及双酶切鉴定以反转录的cDNA为模板，设计的特异性引物进行扩增SAP-2基因。RT-PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。切胶后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段回收，与pMD19-T(simple)载体4 ℃过夜连接，连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞内，筛选出阳性转化
西南农业学报 2018年12期2019-01-18
- 外泌体源性oar-miR-10b在绵羊痘病毒感染绵羊睾丸细胞中的动态表达及靶基因的鉴定
LO空载体并进行双酶切，将双酶切的目的片段BCL2L2和PmirGLO 16℃过夜连接，将构建的重组载体转化入DH5α感受态细胞，培养18 h后提取重组质粒，并进行双酶切鉴定。1.2.5 双荧光素酶报告基因的检测 取生长状态良好的293FT细胞，以5×104CPU接种于96孔板，过夜培养后，弃掉培养液后每孔加入100 μL的DMEM无血清培养基，置于室温平衡15 min以上。每孔加入100 μL的Dual-Glo®Luciferase Reagent，室温
动物医学进展 2018年12期2018-12-24
- 家蚕非编码RNA Bm-152功能初探
mHI、NcoI双酶切actinA3启动子，连接在pFBDM载体上，获得pFBDM[A3]载体.NcoI、KpnI双酶切Bm-152 PCR产物，连接在pFBDM[A3]上，获得pFBDM[A3-Bm-152]载体.BamHI、BglII双酶切pFBDM[A3-Bm-152]载体，BglII双酶切piggyBac[A3-EGFP]，连接获得piggyBac[A3-EGFP-A3-Bm-152]过表达载体.阴性对照为实验室之前构建成功的piggyBac[A3
信阳师范学院学报（自然科学版） 2018年1期2018-08-09
- 戊型肝炎病毒与ING5相互作用的研究
和HindIII双酶切，胶回收载体和目的基因片段，以T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，并转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆，提取质粒，用BamHΙ和HindIII双酶切鉴定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为PGC-ING5。反应体系如下：PGC载体骨架(200 ng)5 μL，目的片段(100 ng)12 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，total
中国人兽共患病学报 2018年7期2018-07-31
- 人参3-O-UGT1基因RNAi表达载体工程菌的构建
T和正义片段同时双酶切，纯化酶切产物，使用T4 DNA连接酶进行连接，将测序验证后的重组载体命名为pMD-S；使用SmaⅠ/SacⅠ限制酶对重组质粒pMD-S和反义片段同时双酶切，纯化酶切产物，使用T4 DNA连接酶进行连接，采用热转化法将连接产物转化至E.coliJM109感受态细胞中，提取质粒进行双酶切和测序验证。将验证后的重组载体命名为pMD-3UGT1-RNAi(3种重组质粒结构如图1所示)。图1 三种重组载体结构示意图Fig. 1 Schemat
吉林大学学报（工学版） 2018年1期2018-03-10
- BamHⅠ+XhoⅠ双酶切质粒电泳弥散原因初探
mHⅠ+XhoⅠ双酶切质粒电泳弥散原因初探金科华1,2,张惠敏3,杨志珅3,金天颖3,卢晓晓3(1湖北科技学院医药研究院,咸宁 437100;2湖北科技学院基础医学院基础医学研究所;3湖北科技学院基础医学院)目的 探讨TaKaRa公司(中国大连)快速限制酶BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃双酶切质粒pET-28a、pET-28a-SDHA产生弥散的原因。 方法 比较4种条件下酶切对弥散的影响:①BamHⅠ+XhoⅠ 37 ℃双酶切Elution Buffer(
山西医科大学学报 2017年11期2017-12-01
- 靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证
hoI和HpaI双酶切后的pLL3.7慢病毒表达质粒中，构建重组的pLL3.7-YWHAE-shRNA表达质粒和pLL3.7-NC-shRNA阴性对照质粒，转化大肠杆菌感受态细胞Stable3，挑取重组阳性菌落抽提质粒行双酶切及测序(福州铂尚生物技术有限公司)鉴定。siYWHAE-1：F：5′-TGCTGAGCAGTTGTCCGCGTTTCAAGAGAACGCGGACAACTGCTCAGCTTTTTTC-3′R：5′-TCGAGAAAAAAGCTGAGCA
福建医科大学学报 2017年3期2017-08-11
- 噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的原核表达与鉴定
oRⅠ与SalⅠ双酶切，产物回收后用T4连接酶连接，转入大肠埃希菌DH5α后挑菌提取质粒，将所得的质粒分别进行PCR与双酶切鉴定,选出阳性克隆，命名为pET-28a-EGFP。送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，以确保插入基因的准确。将目的基因片段gp37与测序正确的重组质粒pET-28a-EGFP用SalⅠ与XhoⅠ双酶切，双酶切产物回收后连接，转入大肠埃希菌DH5α后挑菌提取质粒，将所得的质粒分别进行PCR与双酶切鉴定,选出阳性克隆，命名为pET-
动物医学进展 2016年5期2017-01-06
- 鱼腥藻PCC7120染色体基因对asr0757/alr0758的表达优化及其鉴定
过菌落PCR以及双酶切鉴定后送测序.测序正确后保存质粒，分别命名为 pMD18-T-asr0757和pMD18-T-alr0758．表1 PCR引物及序列注：下划线为括号内对应限制性内切酶识别的酶切位点序列．1.2 .3重组表达载体 pET-30a-asr0757，pET-30a-alr0758的构建BamH1和EcoR1双酶切测序正确的质粒pMD18-T-asr0757、pMD18-T-alr0758以及表达载体pET-30a(+)，回收各自双酶切目的片
华中师范大学学报（自然科学版） 2016年2期2016-11-29
- pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒真核表达载体的构建与表达
和EGFP-C3双酶切，构建EGFP-C3-GRK2-S670A，SalI/BamHI双酶切EGFP-C3-GRK2-S670A和pIRES-EGFP，得到pIRES-EGFP-GRK2-pIRES-EGFP-GRK2-S670A突变质粒；重组质粒；细胞转染G蛋白偶联受体激酶2(Gprotein-coupledreceptorkinase2，GRK2)在G蛋白偶联受体(G-protein-coupledreceptors，GPCRs)信号转导中起着重要作用
安徽医科大学学报 2016年10期2016-11-25
- 基因工程中的单酶切与双酶切
现象，实验中常用双酶切的方法。2 双酶切双酶切，即采用两种不同的限制酶同时处理目的基因和质粒。因为限制酶具有特异性，不同的酶作用于不同的碱基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。当应用DNA连接酶进行连接时，就只能存在一种正连情况，而不会出现反连的问题。正因为可以有效地防止错误连接的现象出现，双酶切的做法被广泛应用于基因工程中表达载体的构建，也可以用于制备体外转录的模板。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象，可
生物学教学 2016年6期2016-08-20
- 双酶梭菌TK6的筛选及益生物质对其代谢活力的影响
300457）双酶梭菌TK6的筛选及益生物质对其代谢活力的影响李敬杰，刘金辉，王海宽 （工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）本实验采用倾注法从健康成年人的粪便中筛选双酶梭菌（Clostridium bifermentans）TK6，该菌有益于反刍动物，其发酵产物有消化酶、短链脂肪酸以及α-酮异己酸（KIC）等益生物质.分别利用7种低聚糖（低聚葡萄糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、棉籽糖以及水苏糖）
天津科技大学学报 2016年3期2016-08-02
- 鹿骨双酶法酶解工艺的研究
0012）鹿骨双酶法酶解工艺的研究于浩，张海悦*，李震，杨雪 （长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）摘要：以新鲜鹿骨为原料，探讨鹿骨酶解的最佳工艺条件；以水解度为指标，确定以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为试验用酶，通过正交试验确定鹿骨双酶法酶解的最佳工艺条件。结果表明：碱性蛋白酶在pH 9.0、温度50℃的条件下水解时间为3 h，再在pH 8.0、温度37℃条件下，加入胰蛋白酶水解2 h，此时的水解度为12.72%，分别是碱性蛋白酶和胰蛋白酶最
食品研究与开发 2016年9期2016-06-13
- 超声波辅助复合酶提取鸡软骨中硫酸软骨素
用超声波辅助碱-双酶法提取硫酸软骨素，以硫酸软骨素得率为考察指标，选取最优提取方法，并对最优方法进行单因素试验和响应曲面优化.试验结果表明，最佳工艺参数为超声波功率500 W，超声时间120 min，碱性蛋白酶添加量为1%，木瓜蛋白酶添加量为2%，硫酸软骨素得率可达到36.08%.超声波辅助碱-双酶法耗时短，操作简单且得到的产品纯度高.关键词：鸡软骨；硫酸软骨素；双酶；超声波硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)又称牛磺软骨素、康得宁，
哈尔滨商业大学学报（自然科学版） 2016年1期2016-04-22
- 质粒抽提策略对双酶切鉴定的影响
@qq.com)双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定DNA重组成功与否的重要方法［1］，琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作［2］，而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)重组质粒pET-28a-G6PD时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳
山西医科大学学报 2015年6期2015-12-16
- BikDD肿瘤靶向基因治疗抑制淋巴瘤细胞生长研究＊
对PCR产物进行双酶切后纯化回收，连入同样用BgiⅡ/HindⅢ双酶切的pGL3－Basic载体，构建成pGL3－Bik载体。利用PCR及 HindⅢ/BgiⅡ双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司纯化测序。1.2.2 pGL3－BikDD 载体的构建 根据 GenBank的Bik基因序列，为实现将Bik基因编码蛋白第33位苏氨酸残基和第35位丝氨酸残基替换为门冬氨酸，对其编码基因进行定点突变，分别将第33位苏氨酸残基编码基因ACT突变为GAC，第35位丝
成都医学院学报 2015年1期2015-12-06
- 胶质细胞源性神经营养因子基因克隆及表达载体的构建
I和XhoI进行双酶切反应，双酶切产物经0.8%瓊脂糖凝胶电泳检切出DNA条带用胶回收试剂盒纯化后合并，加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜1.2.3转化感受态细菌、细菌的扩增及质粒提取取上述连接后反应液10ul，加感受态细菌JM109 100ul冰上放置20min，然后420C热休克2min， 加1ml LB，37 0C震荡培养30min， 取100ul涂布到卡那霉素培养平皿上，370C培养过夜。然后挑起单个克隆接种到5ml LB+Kana培养液中37
医学美学美容·中旬刊 2015年2期2015-10-21
- 高效PiggyBac转座酶的构建与筛选
mHⅠ和XhoⅠ双酶切并纯化回收后，用T4 DNA连接酶将其骨架与两端带有BglⅡ和XhoⅠ酶切位点的双链DNA片段于16 ℃连接过夜后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含100 mg/L氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜，挑取单克隆，接种于2 mL含100 mg/L Amp的LB培养液中，37 ℃、250 r/min 培养10 h，提取质粒，经XhoⅠ和SmaⅠ双酶切鉴定，酶切产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将构建正确的转
西北农林科技大学学报（自然科学版） 2015年8期2015-07-02
- 聚能双酶水溶肥
聚能双酶水溶肥能提高作物对糖类物质的合成率，能改良和活化土壤、改善作物品质、提高作物抗逆力。聚能双酶水溶肥水溶性好，富含活性蛋白双酶，能大大提高农作物对肥料中各种养分的吸收率和利用率，有效解决各元素之间的颉颃，促进作物快速生长。在生产中使用聚能双酶水溶肥，可提高作物的坐果率，促使果实着色均匀，提早作物上市10～15天，延长收获期20～30天，减少腐烂畸形果，每亩还可节省化学肥料30%左右，增产增收效果明显。（江西 绿洲）
农村百事通 2015年8期2015-05-19
- 不同肌肉特异性启动子IGF2表达载体构建及对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响
T克隆载体连接，双酶切鉴定正确后命名为pMD-18T-IGF2，送由北京英骏公司测序。1.2.2 表达载体pcDNA3.1(+)-IGF2的构建 用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切获得目的片段，用同样的酶双酶切pcDNA3.1(+)载体，回收纯化后，用T4 DNA连接酶连接转化至DH5α感受态细胞中，挑选单克隆，提取质粒并酶切鉴定，成功构建pcDNA3.1(+)-IGF2载体。1.2.3 pGL3-desminpro-IGF2、pGL3-CMV-My
畜牧兽医学报 2015年4期2015-03-22
- 生殖支原体MG 427原核表达载体的构建和鉴定
1空载体的酶切 双酶切总体积为40.0μL，均含: 10×NEB bu ffer 3 4.0μL；100×BSA 0.4μL；BamHI 1.0μL；NotI 1.0μL；其中PCR双酶切体系中加mg427纯化产物10.0μL；d d H2O 23.6μL； pGEX-6 p-1载体双酶切体系中加PGEX-6P-1 15μL；ddH2O 18.6μL；然后分别置入37℃水浴箱中，保温酶切12 h。取酶切后于1.7%的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察目的条带并
当代医学 2015年22期2015-03-12
- 流感病毒多表位核酸疫苗CTB-Eg的构建与细胞转染研究*
位点分别进行单、双酶切鉴定，并回收双酶切产物。1.2.2 重组真核表达质粒pEGFP-C2/CTB-Eg的构建 pEGFP-C2质粒经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切胶回收后，在T4 DNA连接酶的作用下，分别与目的片段CTB、Eg和CTB-Eg连接，载体与目的片段摩尔比为1∶10。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆，摇菌扩增，DNA抽提试剂盒提取质粒，并进行单、双酶切鉴定和基因测序鉴定。1.2.3 HEK
西部医学 2015年2期2015-02-25
- 聚焦酶肥产业共创绿色未来“肥料科技创新暨双酶尿素推广应用营销研讨会”召开
“肥料科技创新暨双酶尿素推广应用营销研讨会”在北京召开。会议探讨了在肥料行业“减肥增效”的背景下，如何通过创新提高肥料利用率，生产绿色、环保的肥料。来自肥料企业的代表、经销商近150人参加了此次会议，并为在双酶尿素推广、应用、销售领域做出突出贡献的经销商进行了颁奖。会上，中国石油与化学工业联合会副会长、中国氮肥工业协会理事长顾宗勤表示，我国作为世界上最大氮肥生产、消费及贸易国，氮肥当季利用率只有33%左右，远低于发达国家。单一的化肥结构已难以适应农业的新变
中国农资 2015年42期2015-01-31
- 聚焦酶肥产业共创绿色未来
“肥料科技创新暨双酶尿素推广应用营销研讨会”召开10月28日，由北京中农瑞利源高科技发展有限公司、山东禹城瑞利源科技有限公司举办的“肥料科技创新暨双酶尿素推广应用营销研讨会”在北京召开。会议探讨了在肥料行业“减肥增效”的背景下，如何通过创新提高肥料利用率，生产绿色、环保的肥料。来自肥料企业的代表、经销商近150人参加了此次会议，并为在双酶尿素推广、应用、销售领域做出突出贡献的经销商进行了颁奖。会上，中国石油与化学工业联合会副会长、中国氮肥工业协会理事长顾宗
中国农资 2015年42期2015-01-31
- 新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建
动子的功能，采用双酶切的方法，用核酸内切酶S acⅠ和N c oⅠ分别双酶切p C AM B IA1304质粒和阳性重组质粒p E A S Y-T1-simple-pMv N H X1，然后回收目的片段。通过T4DN A连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌D H5α，通过画板，卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PC R及双酶切鉴定该载体后，用冻融法将其导入农杆菌E H A105。结果表明，成功培养出含有抗逆相关基因Mv N
湖南农业科学 2015年1期2015-01-10
- 拟南芥AtMYB50和AtMYB61蛋白的原核表达研究
it抽提质粒，用双酶切切下目的条带，电泳检测，回收纯化。测序并确认序列无误。1.2.3 原核表达载体的构建pET－32a＋和pGEX－4T－1用相应的限制性内切酶进行完全双酶切，电泳检测并回收载体片段，与回收好的目的基因片段相连，转化至Trans1－T1感受态细胞，用含有100μg／mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑取单菌落，置于100μg／mL Amp－LB液体培养基，37℃、O／N培养。用 TIANprep Mini Plasmi
合肥工业大学学报（自然科学版） 2014年1期2014-12-31
- 限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切条件的优化
子生物学等领域。双酶切更为广泛应用于载体构建等分子生物学实验，因为单酶切后连接目的基因理论上会出现50%可能的错误性，而双酶切后的不同黏性末端在一定程度上避免单酶切的不足[3]。KpnⅠ和EcoRⅠ是目前常用的限制性内切酶，属第Ⅱ型限制性内切酶，来源方便、价格便宜，广泛应用于分子生物学实验[4]。试剂公司会给出这两种酶的适合缓冲液，但这两种限制性内切酶的最适缓冲液离子浓度相差较大，给这两种酶的应用带来一定不便。本研究选取KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切体系，
吉林医药学院学报 2014年4期2014-08-17
- 肥料有了酶，作物好吸收——访双酶系列肥料发明人孙立文
，记者专程采访了双酶系列肥料发明人孙立文。通过他全方位的介绍和阐述，记者对于“双酶技术”这项即将应用于现代农资产业的新型技术有了更加全面的了解。孙立文向记者介绍说，双酶尿素就是尿素与尿激酶的混合产物，它的物质结构与人尿类似，是一种新型有机肥料。与双酶尿素共同出现在市场上的产品是双酶复合肥，对于农作物而言，双酶复合肥真正地做到了有酶好吸收。说到这里，孙立文用一段形象的顺口溜来概括双酶肥料的特征：叶子是肺、根是嘴，消化吸收全靠酶，双酶肥是肥、却又含酶，是农民增
中国农资 2014年30期2014-08-15
- 谷朊粉酶解条件优化及其抗氧化活性
（碱性蛋白酶）和双酶（碱性蛋白酶＋风味酶）2种方法对谷朊粉进行酶解，通过正交试验优化了酶解条件，并对比分析了2种水解物的抗氧化活性、分子质量及氨基酸组成的差异，从而为谷朊粉酶解物制备抗氧化活性肽提供一定的理论基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器谷朊粉（粗蛋白80.2%）：河南省莲花味精有限公司。碱性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，酶活力2.4 AU／g）、风味酶（Flavourzyme 500 MG，酶活力500 LAPU／g）：丹麦诺维信酶制剂公
中国粮油学报 2014年11期2014-03-13
- IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测
luⅠ和XhoⅠ双酶切,同时质粒小提试剂盒小提质粒pGL3-Enhancer,并经MluⅠ和XhoⅠ双酶切,利用凝胶回收试剂盒回收并纯化酶切产物。将上述制备的IDO启动序列GAS7和ISRE4片段与线性化双粘性末端的pGL3-Enhancer载体片段以3∶1摩尔比的比例用T4 DNA连接酶于16℃循环水浴连接反应过夜,连接产物于60℃灭活10 min后转化至感受态大肠埃希菌DH5α,经氨苄霉素抗性筛选,分别取阳性克隆提取重组质粒pGL3-Enhancer-
中南医学科学杂志 2014年2期2014-03-13
- 大鼠Akt1基因合成及载体构建的实验研究
胶回收试剂盒回收双酶切的大鼠Akt1基因片段和载体pGCMV/MCS/RFP/Neo；4）用T4 DNA ligase连接双酶切得到的大鼠Akt1基因片段和线性化的载体，22℃连接2小时；5）取10μl连接产物转化100μl感受态细胞Top10，均匀涂布于50μg/ml Ampicillin平板，倒置于37℃培养箱中培养约16小时；6）挑取阳性克隆抽提质粒，用酶切法验证。2 结果大鼠Akt1 PCR电泳图片如图1所示。大鼠Akt1-pGCMV/MCS/RF
山东工业技术 2013年12期2013-11-30
- MSTN RNAi双元表达载体构建及效果试验
的片段的亚克隆 双酶切pHANNIBAL、p－M1和p－M2，电泳回收、酶切鉴定、连接，将已插入正向和反向目的片段的中间载体命名为pHA－M1－M2。1.2.4 MSTN RNAi双元表达载体的构建 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pHA－M1－M2和pEGFPN1，电泳回收相应的目的片段，连接，转化，卡那抗性筛选、提取质粒，单、双酶切鉴定。1.2.5 成肌细胞培养 常规方法培养14日龄鸭胚成肌细胞，转染1h后，再加入完全培养基至5mL/孔，继续培养48h。1
中国兽医杂志 2013年7期2013-11-22
- 杜氏盐藻糖原合成酶激酶3 cDNA片段的克隆及其在鞭毛再生中的功能*
RⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，取插入片段大小正确的单克隆菌液送测序，进一步进行鉴定。1.3.3 3’RACE法扩增GSK3 3’端序列 根据已扩增的GSK3片段设计3’RACE上游引物：外侧5’-CCTGGTGCTGGAGTTCGT-3’(18 bp)，内侧5’-ACTACACTGCTGCCATTGAT-3’(20 bp)。下游引物为3’RACE试剂盒自带的引物：外侧 5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’(23 bp)和内侧 5’-CG
郑州大学学报（医学版） 2013年2期2013-11-21
- 含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建*
-T/Can进行双酶切，分别回收载体片段和目的片段。利用T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。挑选单克隆，提取质粒并进行酶切鉴定。2 结果2.1未添加及添加翻译增强序列的人canstatin基因片段的扩增结果RT-PCR所得片段约为700 bp，与预期片段大小基本一致(图1)。图1 人canstatin RT-PCR扩增结果2.2PMD18-T/Can的酶切鉴定PMD18-T/Can经PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切，得到一条载体片段和一条
郑州大学学报（医学版） 2013年5期2013-11-20
- 东方山羊豆Go MIPS双元表达载体的构建及鉴定＊
coI／SpeI双酶切，37℃16 h，经凝胶电泳检测，利用凝胶电泳DNA回收试剂盒分别回收目的片段。在T4连接酶的作用下，将回收的目的片段连接，连接体系为10μL，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取阳性克隆质粒pCAMBIA1302-MIPS。1.3.6 双酶切鉴定 对p CAMBIA1302-MIPS质粒进行NcoI／SpeI双酶切鉴定，取10μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。1.3.7 序列测定与分析 将重组载体pCAMBIA1302-MIPS送Inv
家畜生态学报 2013年1期2013-01-07
- 血管内皮生长因子逆转录病毒表达载体的构建
.1-VEGF的双酶切及目的基因片段胶回收pcDNA3.1-VEGF质粒在大肠杆菌中扩增后测序鉴定,无碱基突变及序列缺失。根据酶切位点选择EcoRⅠ和XhoⅠ两种酶双酶切质粒pcDNA3.1-VEGF和质粒pLXSN,然后进行琼脂糖电泳,用胶回收试剂盒回收570bp目的基因片段。1.2.2 pLXSN双酶切根据pLXSN的多克隆位点,选择EcoRⅠ和XhoⅠ两种酶双酶切。琼脂糖电泳后,用胶回收试剂盒回收6kbp片段。1.2.3 pcDNA3.1-VEGF重
周口师范学院学报 2012年2期2012-12-12
- 库尔勒香梨苹果褪绿叶斑病毒RNAi载体构建及烟草遗传转化
I／Spe I双酶切，回收并连接到piRDG12相应位点，构成piRD＿CLA－r；将CLA－f重组质粒和piRD＿CLA－r分别用 BamH I／Kpn I双酶切，回收并连接，构成中间载体piRD＿CLA。最后，将piRD＿CLA上Xba I／Sac I双酶切片段连接到pBi35SG12相应位点，构成植物表达载体pBi35S＿CLA。将CLB－r质粒用Sac I／Spe I双酶切，收并连接到piRDG12相应位点，构成piRD＿CLB－r；将CLA－f
石河子大学学报（自然科学版） 2012年4期2012-11-02
- 日本血吸虫角化不良蛋白（DKC1）基因克隆与表达＊
增目的基因片段，双酶切，并将其与PET-28a（+）载体连接，转化入DH5a大肠杆菌，经PCR扩增并测序鉴定后，抽提重组质粒，再将其转化入表达菌BL21大肠杆菌中。PCR鉴定阳性重组克隆后，IPTG诱导表达，SDS-PAGE方法检测表达结果，收集、纯化重组蛋白。结果：通过设计上下游引物经PCR法扩增出约1 400bp的DNA片段；将DKC1与PET-28a（+）质粒分别作BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，二者经粘性末端连接并转化DH5a大肠杆菌，PCR筛选阳性
微循环学杂志 2012年4期2012-03-19
- EB病毒BARF1基因真核表达载体的构建
oRI和XbaI双酶切与测序鉴定，证实BARF1基因已克隆到pUM－T载体。凝胶回收双酶切产物BARF1片段，再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)－his，转化E.coli DH5α，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析，确认插入方向。③结果 以B95－8细胞提取RNA进行RT－PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1，得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后，证实目的基因BARF1片段
华北理工大学学报(医学版) 2012年1期2012-01-17
- 重组木聚糖酶的安全高效表达与应用研究
、EcoT221双酶切 pPIC9-xyn2和T-GAP载体，分别回收约 8000bp的大片段和约500bp的GAP启动子片段，连接，转化，构建成毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2。图1 毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建1.2.2.2 毕赤酵母表达载体pGAPHINU-xyn2的构建毕赤酵母表达载体pGAPHINU-xyn2的构建过程如图2所示。以BamHI、SnaBI双酶切 pGAPHαxyn2，回收约8000bp的大片段，与经密码子优化
食品工业科技 2011年1期2011-11-10
- 重组真核质粒pERFP-C1-hTudor-SN-SN(1～4)的构建和表达*
和BamHⅠ进行双酶切，凝胶回收试剂盒回收并纯化各目的片段。表1 Tudor-SN的SN(1～4)功能片段引物序列1.2.2 线性pERFP-C1的获取 采用pERFP-C1质粒载体，见图1。以质粒快速小提试剂盒提取pERFP-C1-Tudor-SN质粒DNA，采用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切pERFP-C1-Tudor-SN质粒，完整切下线性pERFP-C1质粒载体，琼脂糖电泳。凝胶回收试剂盒回收得到约4 700 bp线性pERFP-C1。1.2.3 重
天津医药 2011年2期2011-02-28
- 一种胸腺肽α1的原核表达方法
和HindIII双酶切, 构建ELP-pET41 a(+), 抽提质粒部分进行PflMI和BglI双酶切, 部分PflMI单酶切,双酶切收集的小片段插入单酶切线性化的质粒, 构建成(ELP)2-pET41 a(+), 如此重复构建(ELP)n-pET41 a(+); 将人工合成的Tα1-Gly序列进行退火, 并与构建的(ELP)n-pET41 a(+)进行NdeI和EcoRI双酶切, 连接反应构建Tα1-Gly-ELP[V5-10]-pET41 a(+),
湖南理工学院学报（自然科学版） 2011年4期2011-01-24
- 烟草Bax inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化
Ⅰ与Bam HⅠ双酶切质粒pFGC5941，回收约1.3 kb的CHSA Intron基因片段；用AscⅠ与Bam HⅠ双酶切质粒pGSA1285，回收约9.5 kb的载体片段。将两个片段连接，获得重组质粒。这样，首先向载体中引入了ihpRNA沉默所需的Intron片段。用AscⅠ与Bam HⅠ双酶切鉴定，切出了1.3 kb的片段，证明是所需的含intron片段的重组质粒，命名为pGSA2285（见图1、2）。2.1.2 烟草BI－1基因反向插入载体pGS
东北农业大学学报 2010年1期2010-02-20
- MHCⅡ类转激活因子基因的重组腺病毒载体的构建
oRⅠ和XhoⅠ双酶切，U-Gene凝胶回收纯化3300bp目的基因片段。用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒载体pShuttle-GFP-CMV，用T4DNA连接酶将上述目的基因片段与pShuttle-GFP-CMV片段连接，得到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-CⅡTA，并经KpnⅠ单酶切及测序鉴定。Ⅰ-CeuⅠ/Ⅰ-SceⅠ双酶切处理，回收目的片段，将pAdxsi载体片段和插入片段进行酶连接，得到腺病毒质粒pAdxsi-GFP-CⅡTA，经Xho
中华胰腺病杂志 2009年6期2009-11-27