基因工程中的单酶切与双酶切

舒端阳

(广东省揭阳华侨高级中学 522000)

1 单酶切

由于高中生普遍没有接触过分子生物学，概念上比较模糊，所以高中生物学教材只介绍相对简单的单酶切，有利于学生的理解和接受。但单酶切在实验室操作的时候，容易出现反连甚至是载体之间的自连现象，因此单酶切的方法并非适应基因工程的所有项目。

例如，2012年高考江苏卷第32题就涉及此问题，相关信息如下：图1 表示含有目的基因D的DNA 片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspI、BamHI、MboI、SmaI 4 种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。提出的问题是：若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒。但经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是什么？

分析：根据题意，应采用BamHI进行单酶切。所得到的目的基因D与质粒两头的黏性末端都是相同的。由于在进行连接反应时，目的基因和载体是随机碰撞的，且两者的两端黏性末端都相同。所以，基因D既可以与质粒正向连接(正连)，即目的基因顺时针地按其上游到下游的方向与载体相连(与启动子的顺时针方向一致)，这样，目的基因就能从上游到下游正常转录，表达产生所需的蛋白质，产生预期的性状；目的基因也可以与质粒反向连接(反连)，即目的基因的上下游方向颠倒地与载体相连，结果目的基因的转录从下游到上游，导致密码子全部改变，目的基因不能正常表达。为了防止出现反连现象，实验中常用双酶切的方法。

2 双酶切

双酶切，即采用两种不同的限制酶同时处理目的基因和质粒。因为限制酶具有特异性，不同的酶作用于不同的碱基序列，所以得到的黏性末端也是不同的。当应用DNA连接酶进行连接时，就只能存在一种正连情况，而不会出现反连的问题。正因为可以有效地防止错误连接的现象出现，双酶切的做法被广泛应用于基因工程中表达载体的构建，也可以用于制备体外转录的模板。

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的同源mRNA特异性降解的现象，可以定向地关闭某个基因的表达，因而被广泛应用于生物学的众多领域。要对某个基因进行有效的沉默，就需要得到与这个基因具有相同序列的dsRNA，而制备dsRNA的过程需要应用双酶切和单酶切的处理方法。

如何制备dsRNA呢？通常要选择一种叫做pLITMUS28i的质粒，该质粒最大的特点是带有两个T7启动子，且转录方向是相反的，在两个启动子之间有一些常用的酶切位点。

首先，用双酶切(BamHI和EcoRI)同时处理目的基因和质粒pLITMUS28i；连接后获得重组质粒；将重组质粒平均分成两份，分别被BamHI和EcoRI进行单酶切，获得转录用的模板；加入RNA聚合酶和4种核糖核苷酸(NTP)后，在室温下进行体外转录，得到单链RNA。因为这些单链RNA本身是互补的，所以低温下退火即可制备得到dsRNA，通过脂质体转入相应受体细胞就可用于进行RNAi的相关实验。

图1 含有目的基因D的DNA片段长度和部分碱基序列

图2 一种质粒的结构和部分碱基序列