甘肃党参急性青枯型根腐病病原鉴定与室内毒力测定研究

孙新荣，张西梅，仲彩萍*，胡小平，高薇薇，李鹏霞，漆文选

(1.渭源县农业技术推广中心，甘肃 渭源 748200；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；3.西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；4.渭源县种子管理中心，甘肃 渭源 748200)

党参(Codonopsispilosula(Franch)Nannf.)为桔梗科多年生缠绕或直立草本植物。甘肃定西是著名的千年药乡，是全国药材的重要主产区之一。定西市渭源县2002年被中国农学会特产之乡组委会正式命名为“中国党参之乡”，所产党参以“条直、体胖、色白、质好”而著称。目前，发展党参药材产业成为定西地区重要的扶贫途径。但随着种植面积的不断扩大，病害问题已逐渐成为影响党参产量和品质的重要因素之一。据2013-2017年调查发现，党参大田出现大面积的茎叶急性青枯、烂根现象，当地药农俗称“红芯病”或“黄芯病”，发病率达15%～70%；轻则影响商品价值，重则整片青枯死亡，严重减产，减产幅度10%～60%，是目前最严重的病害之一。王艳等[1]调查研究表明甘肃党参根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。然而，至今关于党参“红芯病”或“黄芯病”新型根腐病的发病症状、流行时期及主要病原菌尚不明确，相关防治技术带有盲目性。因此，笔者通过系统调查党参“红芯病”或“黄芯病”新型根腐病田间发病情况及症状表现，对病原菌进行分离鉴定并筛选效果较好的防治药剂，以期为脱贫攻坚党参产业可持续发展保驾护航。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2013-2017年，每年4-9月于甘肃党参主产区定西市渭源、陇西、临洮等县党参“红芯病”或“黄芯病”发生严重的大田，采集病害标本，观察并记录病害相关的症状。

1.2 病原菌分离培养

采用常规组织分离法分离病原菌[2]，选取新发病参根病健交界处组织(3 mm×3 mm)，先用70%乙醇消毒5 s，0.1%HgCl2表面消毒30 s，无菌水冲洗3～4次，然后在无菌条件下接种于马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose ager，PDA)平板上，于25℃恒温箱内暗培养。对获得的菌落进行单孢分离纯化，将纯化好的菌株接种于PDA斜面培养基上，4℃保存。

1.3 病原菌致病性测定

采用灌根接种法[2]对分离物进行致病性测定。将分离物接种于PDA平板上，25℃恒温箱内培养4 d后，用无菌水冲洗孢子，配制成浓度为1×106个·mL-1的孢子悬浮液，备用。选取健康一年生党参苗，种植于含无菌土的花盆中，出苗20 d后，在距芦头4 cm的参根部位用灭菌针刺伤表皮，立即灌根50 mL孢子悬浮液作为刺伤接种处理，同时设无伤接种处理，以接种相同体积的无菌水作为对照。每个处理接种3盆，每盆种植10株党参。灌根后的党参置于25 ℃人工气候箱培养，定期观察并记录发病情况。同时，对典型发病植株进行再分离，将分离物与初始接种体进行形态学比较。

1.4 病原菌形态学鉴定

将病原菌接种到PDA培养基平板中央，在25 ℃的恒温箱中暗培养，观察菌落生长速度、色泽等形态特征，并挑取菌丝体制成玻片，在显微镜下观察孢子的显微特征，并测量分生孢子大小。

1.5 病原菌分子鉴定

病原菌的分子生物学鉴定委托中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所、西北农林科技大学植物保护学院完成。

1.5.1 DNA提取以及病原菌ITS序列扩增及测序 参照申永铭等[3]的方法。PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

1.5.2 数据分析 将测序结果进行BLAST比对分析。从GenBank下载镰刀菌属代表种序列，将序列信息导入MEGA(6.0)采用Clustal W方法进行序列比对，通过最大拟然法(Maximum Likelihood Tree)构建系统发育树，同时利用Bootstrap(10 000次重复)检验各分支的置信度。

1.6 室内毒力测定

采用生长速率法进行室内毒力测定。供试药剂共7种，采用梯度稀释法配成不同稀释倍数(18%噻灵·咯·精甲、6.25%精甲·咯菌腈、25 g·L-1咯菌腈、70%甲基硫菌灵、50%多菌灵的稀释倍数为100 000、150 000、200 000、250 000、300 000倍；80%乙蒜素为4 000、8 000、12 000、16 000、20 000倍；60.0052%噁霉灵·乙酸为400、800、1 200、1 600、2 000倍)的含药PDA培养基，以不加药剂为对照；将药剂稀释倍数换算为相应的室内毒力测定浓度见表1。

抑菌率(%)=(对照菌落直径-药剂处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

采用DPS软件计算各药剂的毒力回归方程及相关系数(r)，并求出抑制中浓度(EC50)。

2 结果分析

2.1 田间发病情况及症状表现

通过田间大量的系统调查，发现“红芯病”或“黄芯病”症状表现为：发病初期，植株地上茎和叶片下垂、出现急性萎蔫，但叶色仍为绿色、不脱落(图1-B)；参根外观正常，剖开主根，部分或整个维管束变为黄色至红色，形成纵向的变色条带(图1-C)。随着病情进一步发展，地上茎和叶片青枯，须根萎缩，主根出现软腐，不久全株死亡，造成明显缺苗断垄(图1-A)。该病发病较早，4月中下旬出现病株，5-6月份苗期为发病高峰期，发病率15%～70%。从地上显症到全株死亡所需时间较短，一般约6 d。根据田间发病症状，将该病害命名为党参急性青枯型根腐病。

2.2 病原分离结果

采集的70份病样中，68份(97.1%)病样分离到真菌。共获得68株真菌，根据培养性状初步归为DXDS001、DXDS002、DXDS003、DXDS004四类，DXDS002分离频率最高(82.9%，58株)，其他3类均低于10株。

2.3 致病性测定

从每类分离物中选取1个代表菌株，用于致病性测定。结果显示，只有接种DXDS002的植株表现出典型的急性青枯型根腐病症状。刺伤和无伤接种DXDS002后第2 d均显急性青枯型根腐病症状，刺伤接种后第2 d全部发病，无伤接种后第4 d全部发病。再分离物与DXDS002形态学特征一致，符合柯赫氏法则，说明DXDS002为党参急性青枯型根腐病病原菌。

2.4 病原菌形态特征

在PDA培养基平板上暗培养5 d后，DXDS002菌落圆形白色，菌落底部中心部位培养物牵牛紫色，菌丝絮状致密(图2)；产生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子，其中小型分生孢子为卵圆形或肾形，无隔膜或具1个隔膜，大小为(3.9～15.0) m×(1.5～4.5) m；大型分生孢子镰刀状，两端尖，一般具有3～5个隔膜，大小为(18.5～35.6) m×(3.0～5.5) m。根据病原菌的形态特征，依据Booth的镰刀菌属分类系统[4]，病原菌DXDS002初步鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。

2.5 病原菌分子鉴定

病原菌DXDS002的ITS序列与GenBank的序列进行BLAST比对后，利用MEGA6.0转换为meg格式并采用Clustal W方法进行序列比对，建立最大似然树(Maximum Likelihood Tree，ML树)，发现菌株DXDS002的ITS序列与F.oxysporumCBS 140424(KT794176.1)、F.oxysporumCBS 129.24(DQ45370.14)的相似性均为100%(图3)，结合形态学特征进一步将DXDS002鉴定为尖孢镰刀菌F.oxysporum。

表1 药剂对尖孢镰刀菌的抑制效果

2.6 药剂防治结果

从表1看出，25 g·L-1咯菌腈、6.25%精甲·咯菌腈、18%噻灵·咯·精甲的EC50分别为0.1355、0.2720、0.5929 mg·L-1；70%甲基硫菌灵、50%多菌灵的EC50分别为2.2783、2.2301 mg·L-1；80%乙蒜素的EC50为37.3332 mg·L-1；60.0052%噁霉灵·乙酸的EC50最高，为4 746.0990 mg·L-1。

3 结论与讨论

王艳等[1]研究表明，引起甘肃地区党参根腐病的病原菌为F.oxysporum。研究表明，引起党参“红芯病”或“黄芯病”的病原菌也为F.oxysporum，这和以往研究结论一致，但同一病原菌引起的主要发病症状不同。

本研究发现党参“红芯病”或“黄芯病”发病初期，植株地上茎和叶片下垂、出现急性萎蔫，但叶色仍为绿色、不脱落，参根外观正常，剖开主根，部分或整个维管束变为黄色至红色，形成纵向的变色条带。随着病情进一步发展，地上茎和叶片青枯，须根萎缩，主根出现软腐，不久全株死亡，造成明显缺苗断垄；且“红芯病”或“黄芯病”发病较早，一般4月中下旬出现病株，5-6月苗期为发病高峰期，与以往报道根腐病的发病与流行时间有所不同[1]，可能是由于根腐病的发生受土壤、气候条件影响较大[2]。近年来，“红芯病”或“黄芯病”发病率在15%～70%，已经成为甘肃党参产区普遍发生的最严重病害。因此，本研究根据主要发病症状将“红芯病”或“黄芯病”定名为急性青枯型根腐病。

化学农药以其简便的使用方法和良好的短期效应优势一直是我国中药材病害防治中最常用的方法。目前，对于党参根腐病的防治，报道较多的农药有多菌灵、乙酸铜，一般整地时拌土，或栽培时用甲基硫菌灵、多菌灵浸种[1,4]。本研究选用7种农药，包括生产上常用农药甲基硫菌灵和多菌灵，复配农药噁霉灵·乙酸，种子处理剂咯菌腈、精甲·咯菌腈和噻灵·咯·精甲，植物源仿生杀菌剂乙蒜素，室内毒力测定表明，3种种子处理剂效果最好，好于生产上以往使用的甲基硫菌灵、多菌灵，可作为多菌灵、甲基硫菌灵的替代农药。