敲减CDKL5对人胶质母细胞瘤细胞表观遗传学的影响①

张惊宇 郑永慧 初婷婷

(黑龙江省医学科学院,哈尔滨 150081)

近期有研究发现CDKL5敲除鼠的运动协调性差、少动、视力差，惊厥处理时脑电图异常，视觉诱发反应下调，这与雷特综合征和自闭症的表型相似[1]。敲除鼠的神经干细胞增殖更快，新生颗粒神经元凋亡水平更高，导致分化的成熟神经元减少，树突严重萎缩，皮层更薄[2]。敲除CDKL5虽然抑制神经元的分化，却不影响胶质细胞的分化[3]。敲除鼠脑中Akt、AMPK、PKC和MAKP信号通路受到影响，其中主要抑制Akt及下游mTOR、RSK和GSK-3β的磷酸化。抑制GSK-3β的活性可改善CDKL5敲除的神经干细胞向神经元分化的缺陷[4]。此外，在成纤维细胞中，CDKL5通过调控剪切调控蛋白的磷酸化状态来控制核小斑的形态，核小斑能持续为活性转录位点提供剪切因子，且确定CDKL5影响选择性剪切[5]。CDKL5还调控基因表达。在CDKL5突变的诱导型多能干细胞中，GluD1(glutamate D1 receptor)的表达下调。GluD1能诱导皮层神经元的抑制性突触前分化，与神经疾病有关。 CDKL5的表达受到表观遗传学调控。神经系统中(脑纹状体和前扣带皮层、PC12细胞)MeCP2和DNA甲基转移酶都抑制CDKL5的表达[6,7]，而MeCP2和Dnmt1正是CDKL5的激酶底物[8]。

1 材料与方法

1.1材料 细胞培养板购自美国corning公司；所有培养基及添加剂均购自美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司；载体pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA购自纽恩生物科技公司；CDKL5(ab22453)购自Abcam公司；GAPDH购自Sigma-Aldrich公司；Dnmt1购自Cayman公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胶质母细胞瘤细胞系U87添加1%非必需氨基酸和1%(1 mmol/L)丙酮酸钠；所有细胞均置于37℃恒温培养箱中培养，CO2浓度5%。

1.2.2质粒构建 构建CDKL5 shRNA所用的载体为pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。实验涉及的shRNA序列为shCDKL5 R：5′-CCGGAGTGAGAGCTAAAG-GCATTTTCAAG-3′,F:5′-AGAAATGCCTTTAGCTCTCACTTTTTTTG-3′。……