羊泰勒虫套式PCR检测方法的建立

田万年，宋旗，孙凰员，郑秀红

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院，吉林 吉林 132101；2. 吉林省龙井市德新乡畜牧兽医站，吉林 龙井 133400)

羊泰勒虫病是由泰勒虫寄生于羊红细胞或网状内皮细胞内引起的经蜱传播血液原虫病[1]。本病以体表淋巴结肿大、贫血、血红蛋白尿为主要特征，对羔羊和外地引进羊危害严重[2]。羊泰勒虫病的诊断一般为血涂片染色后，通过显微镜观察红细胞内虫体确诊，近年来随着分子生物技术的迅速发展，相继建立了检测羊泰勒虫PCR和荧光定量PCR方法[3-4]。传统病原学血液涂片镜检受人为因素影响较大，容易出现漏检和误诊，PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点，已广泛应用于羊泰勒虫病的诊断和流行病学分析[5-6]。泰勒虫主要表面蛋白(major piroplasm surface protein, MPSP)是泰勒虫感染红细胞阶段虫体分泌的一种膜内蛋白，是泰勒虫所特有的膜表面蛋白, 其编码的基因在遗传分类和分子诊断方面具有较好应用价值[7-8]。目前，国内尚未见套式PCR检测方法应用于羊泰勒虫病诊断的研究报道。本试验利用羊泰勒虫MPSP基因的特异性，建立了羊泰虫套式PCR检测方法，为基层兽医工作人员对该病的诊断提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

30份绵羊抗凝血于2017年5月采自吉林省珲春地区，同时用载玻片制作血涂片供染色镜检。

1.2 血液涂片染色

制成的血液涂片滴加甲醇固定，放入装有吉姆萨染液的染缸中，室温染色6 h，然后取出血液涂片用蒸馏水冲洗，自然晾干后显微镜镜检。……