响应面法优化超临界二氧化碳萃取苦参碱工艺技术

姚 众，张贵云，张丽萍，刘 珍，范巧兰，吕贝贝

（山西农业大学棉花研究所，山西运城044000）

苦参碱（matrine）是中药材苦参（Sophora flavescens）的提取物，不仅广泛应用于医药，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等作用[1-4]，而且是一类低毒、低残留、环保型植物源农药，对多种病虫害的防治和植物生长调节均有较好的作用[5-6]。《中国药典》2015 版中以氯仿为溶剂，超声波提取法提取苦参碱[7]，工业生产中，亦采用渗漉法、温浸法、回流法、快速溶剂萃取法等多种传统方法进行萃取[8-9]。虽然方法简单，但存在大量使用有机溶剂、有效成分损失较多、提取率低、污染环境、安全性低等问题[10]。超临界CO2流体萃取技术作为一种新型的萃取分离技术，具有保持生物活性、提取率高、操作简便、效率高、无残留溶剂等优点，适用于植物源农药的提取[11-12]。梁燕明等[9]对比分析了渗漉法、温浸法与超临界CO2流体萃取技术从山豆根中提取苦参碱的工艺优劣特点，结果表明，超临界萃取法萃取的苦参碱含量要高于传统方法。

响应面试验设计是基于多项式方程与试验数据拟合的数学和统计技术的集合，能够迅速有效地对多个影响因素进行交叉考察，获得最佳的提取工艺条件[13-14]。与传统的正交设计和均匀设计相比，响应面设计通过较少的试验次数快速建模，可在整个区域内对试验各个水平进行连续分析，并考虑了试验的随机误差，所得回归方程精确度高，具有突出的优越性[15-16]。

本研究以苦参碱萃取率为响应值，以影响苦参碱萃取率的萃取压力、萃取温度、萃取时间和夹带剂用量为自变量，运用Design-Expert 软件进行响应面试验设计，对苦参碱超临界CO2萃取工艺进行优化，旨在探求苦参碱超临界CO2萃取的最佳工艺条件，为超临界CO2萃取苦参碱的深入研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试样品为豆科植物苦参的干燥根，于2017 年8 月下旬采集于山西汾阳。

1.2 仪器与试剂

HA220-50-06 型超临界CO2萃取仪（江苏华安科研仪器有限公司）；1790 气象色谱仪（安捷伦科技上海分析仪器有限公司）；Sartorius BSA224SCW 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；HR-10 多功能粉碎机（上海哈瑞斯电器有限公司）；HHB11600 型电热恒温培养箱（宁波医疗器械二厂）。

苦参碱标品（中国食品药品检定研究院）；邻苯二甲酸二辛酯（石家庄市有机化工厂）、无水乙醇、氨水均为分析纯；CO2购于廷威气体有限公司（纯度＞99%）。

1.3 试验方法

1.3.1 苦参碱超临界CO2萃取方法 采集的苦参于45 ℃干燥箱中干燥至恒质量，用粉碎机粉碎后过0.25 mm 筛。精密称取100 g苦参粉末，加入0.5 mol/L氨水浸润过夜。次日装入1 L 萃取缸中，同时根据试验要求将夹带剂放入夹带剂罐中，接通制冷开关，将冷箱温度控制在4 ℃，接通水循环。通入CO2后，控制合适的萃取温度、萃取压力、萃取时间、夹带剂用量等试验条件进行萃取。

1.3.2 苦参碱含量测定 采用气相色谱法，以邻苯二甲酸二辛酯为内标物，参考单炜力等[17]的方法对苦参碱含量进行测定，稍有修改。

1.3.3 萃取工艺响应面试验 根据预试验，确定不同因素及水平值，选取萃取温度（A）、萃取压力（B）、萃取时间（C）、夹带剂用量（D）为自变量，以苦参碱萃取率（Y）为响应值，运用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken 响应面设计，试验因素及水平设计如表1 所示。

表1 Box-Behnken 试验因素水平

1.3.4 验证试验 根据响应面试验结果分析，得出超临界CO2萃取苦参中苦参碱的最佳工艺条件，并在优化条件下萃取苦参碱，通过比较预测值和试验值验证模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 模型的建立与显著性检验

表2 响应面Box-Behnken 试验结果分析

利用统计分析软件Design-Expert 8.0，采用响应 面法进行试验设计，以表2 中苦参碱得率（Y）对自变量萃取温度（A）、萃取压力（B）、萃取时间（C）和夹带剂用量（D）进行回归分析，得到回归方程：Y＝-35.36 ＋0.34A ＋1.49B ＋0.68C ＋0.89D－5.00×10-5AB＋4.50×10-3AC＋3.75×10-3AD＋0.01 BC＋0.03BD ＋0.10CD-2.80×10-3A2-0.03B2－0.22 C2－0.37D2。

试验模型的方差分析（表3）结果表明，本研究模型极显著（P＜0.000 1），失拟性不显著，说明方程有很好的拟合性，苦参碱得率回归模型能够代表苦参碱实际萃取得率。对模型进行回归方程系数显著性检验可知，A、B、C、D、BD、A2、B2、C2、D2对苦参碱得率影响显著（P＜0.05）。各个因素对苦参碱萃取率的影响不是单纯的线性关系，对其提取工艺影响因素从大到小排序为萃取压力（B）＞萃取时间（C）＞萃取温度（A）＞夹带剂用量（D）。

表3 响应面试验回归方程的方差分析

2.2 响应面分析

根据响应面选择的回归模型绘制响应面图，直观反映响应值与各因素以及各因素之间的相互关系。由图1～6 可知，响应面曲面图开口均朝下，响应面模型具有最高点，说明本试验存在最优解。响应面的陡峭程度可反映出各因素对响应值的影响程度。响应面越陡峭，表明该因素对响应值影响越显著，响应面越平缓则相反[18-19]。从图1～6 还可以看出，萃取压力对苦参碱萃取率影响最为显著，与方差分析结果一致。

等高线图可反映出2 个因素交互作用的强弱，等值线呈椭圆形表明交互作用显著，等值线呈圆形则相反[20]。由图1～6 可知，温度和夹带剂用量之间交互作用较弱，其余各因素彼此间交互作用显著。

2.3 最佳提取工艺确定与验证

根据响应面优化结果可知，超临界CO2萃取苦参中苦参碱的最佳工艺条件为：萃取温度65.64 ℃、萃取压力32.02 MPa、萃取时间229.8 min、夹带剂用量为物料质量的3.48 倍，在此条件下苦参碱得率理论上为2.444 1%。

考虑到设备实际运行情况，从方便可行角度考虑，选取萃取温度66 ℃、萃取压力32 MPa、萃取时间230 min、夹带剂用量为物料质量的3.5 倍，为苦参碱最佳萃取工艺。经过3 次平行试验验证得出，苦参碱平均得率为2.38%，理论值与实际值之间的相对误差为2.46%，差异不显著，说明该方法与实际情况拟合良好，具有实用价值。

3 结论与讨论

本研究获得响应面法优化超临界CO2萃取苦参中苦参碱最佳工艺条件为：温度66 ℃、压力32 MPa、时间230 min、夹带剂用量为物料质量的3.5 倍。4 种因素对苦参碱萃取率的影响从大到小排序为：萃取压力＞萃取时间＞萃取温度＞夹带剂用量。验证试验中苦参碱的萃取率为2.38%，与模型预测结果相符。

超临界CO2萃取中压力变化及CO2的穿透作用可使苦参细胞壁脆性增强，通透性提高，亦可使苦参碱溶出性增强，进而提高苦参碱萃取率[21]。在工业化生产中，由于超临界产品投资运行成本高、产业规模小、自动化连续生产难等一系列原因，使超临界CO2萃取技术工业化普及率不高。但超临界CO2萃取技术有其独特的优越性，是一种高质高效、环境友好的萃取方法，为越来越多的科技工作者所重视，这对加快其工业化进程起到一定的促进作用[22]。本试验得到的苦参超临界CO2萃取苦参碱的最佳工艺可为后续试验及工业生产提供一定的理论参考，但实验室环境不能代表生产上的扩大化生产，还需通过中试试验来验证相应的技术效果。