桃红四物汤促进自噬抑制氧糖剥夺诱导心肌细胞凋亡的实验研究

郑 祥 王 审

心肌缺血损伤是冠心病主要病理表现，临床上常用硝酸酯类、β 受体阻滞剂及他汀类药物治疗冠心病，但长期使用会导致严重副作用[1]。桃红四物汤（TST）广泛应用于高血压、心绞痛等心血管疾病治疗[2]。临床研究表明，桃红四物汤可减轻冠心病临床症状，提高患者生活质量[3]。减小脑缺血损伤梗死面积，发挥保护作用[4]。心肌缺血性损伤导致心肌细胞凋亡，抑制凋亡显著改善心血管疾病症状[5]。自噬通过降解受损蛋白质或冗余细胞器维持细胞稳态，介导细胞凋亡过程，与心血管疾病病理过程有关[6-7]。缺血条件下激活心肌细胞自噬，可减轻缺血损伤[3]。研究发现，桃红四物汤成分当归可激活自噬[8]。本研究探讨桃红四物汤对心肌缺血的保护作用及其机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 细 胞 H9C2 心肌细胞（ATCC，#FS-0056），购自上海研生生化试剂有限公司。

1.2 动 物 实验清洁级健康雄性SD 大鼠12 只，体质量（220±20）g，浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号∶SYXK（浙）2018-0012，动物伦理审批号2018111，动物饲养及实验操作严格遵守实验动物的使用和管理原则。

1.3 试 剂 抗体∶微管相关蛋白轻链3Ⅱ/3Ⅰ（LC3-Ⅱ/Ⅰ，批号12741）、核孔糖蛋白62（p62，批号16177）、B-细胞淋巴瘤因子2 相关X 蛋白（Bax，批号2772）、B-细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2，批号15071）和甘油醛酸3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号5174）抗体，购自美国Cell Signaling Technology 公司；试剂∶四唑盐（MTT）试剂盒（InvitrogenTM，批号V13154），Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒（InvitrogenTM，批号V13242），PVDF 膜（InvitrogenTM，批号IB401002），购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。

2 实验方法

2.1 TST 制备 TST∶桃仁、红花、熟地黄、当归、川芎、白芍（购自北京同仁堂浙江中药材有限公司）各15g，加水450mL（按每克生药加水5mL），浸泡2h，煮沸后文火慢煎40min，趁热过滤滤液，自然滴尽，二煎加水270mL，按每克生药加水3mL，煮沸后，文火慢煎40min，趁热过滤滤液，自然滴尽，合并滤液，95℃水浴浓缩至90mL，浓度为1mg/mL。

2.2 TST 含药血清制备 12 只SD 大鼠按照随机数字表法分为空白血清制备组和TST 含药血清制备组，每组6 只。含药血清制备组大鼠每日按体质量给予TST 水煎液10mL/kg 灌胃，含生药剂量为10g·kg-1·d-1，早晚各灌胃1 次，连续5 天，末次给药前12h 禁食，不禁水，末次给药60min 后，水合氯醛腹腔麻醉，从心脏无菌采血。采集的大鼠全血于4℃静置30min后，低温离心机1500rpm/min 离心5min，分离的血清用0.45μm 的微孔滤膜过滤除菌，经56℃恒温水浴、30min 灭活处理后，置于-20℃冰箱备用。空白血清制备组大鼠每只灌胃蒸馏水2mL，其余方法同上。

2.3 心肌细胞氧糖剥夺（OGD）模型制备及分组处理OGD 模型模拟心肌梗死的体内条件，制备方法参照文献[9]，大致过程∶细胞融合达到80%～90%后将细胞培养液转化为无血清、无糖的DMEM，在95%N2、5% CO2饱和的缺氧室中37℃孵育4h。对照组细胞用含10% FBS 的高糖DMEM 培养。将OGD 处理后的细胞采用随机数字表法分为∶对照组、OGD 模型组、OGD+TST 含药血清组、OGD+TST 含药血清+雷帕霉素组、OGD+TST 含药血清+氯喹组。OGD+TST含药血清组∶用TST 含药血清处理24h；TST 含药血清+雷帕霉素组∶用TST 含药血清和25nM 雷帕霉素处理24h；TST 含药血清+氯喹组∶用TST 含药血清和10μM 氯喹处理24h。

2.4 MTT 法检测心肌细胞活力 H9C2 心肌细胞按4×104密度接种于12 孔板中，分组处理后，每孔加入100μL MTT 原液（5mg/mL），37℃孵育30min。然后每孔加入300μL 二甲基亚砜，平板轻轻摇动10min，在550nm 分光光度计微平板阅读器上读取OD 值。用光密度作为细胞存活率的指标，以对照培养基中培养的细胞的光密度归一化，统计各组细胞存活情况。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 采用Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。105个细胞悬浮于缓冲液中，进行Annexin V-FITC 和PI 染色，黑暗中室温下孵育1h。使用FACS 流式细胞术和Cell-Quest 软件分析凋亡细胞数。

2.6 Western blot 检测细胞蛋白表达 操作方法大致如下∶20μg/mL 的蛋白经10% SDS-PAGE 处理后转移到PVDF 膜上。将膜在4℃分别与Bcl-2（1:1000）、Bax （1:1000）、LC3-Ⅰ/Ⅱ（1:1000）、p62（1:5000）或GAPDH（1:5000）抗体孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔/小鼠IgG 抗体（1:5000）室温下孵育2h，使用化学发光试剂显色检测蛋白表达，ImageJ 软件统计分析蛋白灰度。

2.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件分析数据，数据以均数±标准差（） 表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及t 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TST 含药血清提高OGD 心肌细胞活力 不同浓度TST 含药血清处理OGD 心肌细胞24h，MTT 检测结果显示，随着TST 含药血清浓度的增加，细胞活力显著升高（P＜0.05），见表1。

表1 各组心肌细胞活力比较（%，）

表1 各组心肌细胞活力比较（%，）

注∶OGD 为氧糖剥夺；TST 为桃红四物汤；与对照组比较，aP＜0.05；与OGD 模型组比较，bP＜0.05；与OGD+5%TST 含药血清组比较，cP＜0.05；与OGD+10%TST 含药血清组比较，dP＜0.05

3.2 TST 含药血清联合自噬提高OGD 心肌细胞活力 雷帕霉素诱导OGD 心肌细胞自噬，联合TST 含药血清处理OGD 心肌细胞，细胞活力显著升高（P＜0.05），氯喹抑制OGD 心肌细胞自噬，联合TST 含药血清处理OGD 心肌细胞，细胞活力下降（P＜0.05）。见表2。

3.3 TST 含药血清联合自噬抑制OGD 心肌细胞凋亡 与对照组比较，OGD 模型组心肌细胞凋亡比例显著升高（P＜0.05）；TST 含药血清处理OGD 心肌细胞，细胞凋亡比例降低（P＜0.05），雷帕霉素诱导OGD心肌细胞自噬，细胞凋亡比例进一步降低（P＜0.05），氯喹改变溶酶体pH，溶酶体功能受损，细胞自噬被抑制，细胞凋亡比例升高（P＜0.05）。见表3、插页图1。

表2 各组心肌细胞活力比较（%，）

表2 各组心肌细胞活力比较（%，）

注∶OGD 为氧糖剥夺；TST 为桃红四物汤；与对照组比较，aP＜0.05；与OGD 模型组比较，bP＜0.05；与OGD+TST 含药血清组比较，cP＜0.05

表3 各组心肌细胞凋亡比例比较（%，）

表3 各组心肌细胞凋亡比例比较（%，）

注∶OGD 为氧糖剥夺；TST 为桃红四物汤；与对照组比较，aP＜0.05；与OGD 模型组比较，bP＜0.05；与OGD+TST 含药血清组比较，cP＜0.05

3.4 TST 含药血清促进OGD 心肌细胞自噬抑制凋亡蛋白表达 与对照组比较，OGD 模型组p62 和Bax 蛋白表达增多、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bcl-2 蛋白表达减少；与OGD 模型组比较，TST 含药血清处理OGD 心肌细胞，Bcl-2 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明显增多，Bax 和p62 表达明显减少；与OGD+TST 含药血清组比较，OGD+TST 含药血清+雷帕霉素组Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增多，Bax 和p62 表达显著减少；OGD+TST 含药血清+氯喹组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2 表达减少，p62、Bax 蛋白表达增多。见插页图2。

3 讨论

心肌细胞凋亡是冠心病等心血管疾病的重要病理表现，抑制心肌细胞凋亡可有效改善心血管疾病心功能[10]。本研究通过体外OGD 处理心肌细胞构建心血管疾病体外模型，通过不同浓度TST 含药血清处理OGD 心肌细胞，发现细胞活力升高，细胞凋亡比例下降，表明TST 对心肌缺血损伤具有保护作用，但具体机制尚不明确。

自噬在心肌缺血损伤中发挥复杂作用，自噬抑制加重缺血损伤，腺苷和白藜芦醇等心脏保护剂抑制自噬减轻心肌损伤[11-12]。目前普遍认为适度的自噬通过降解和清除受损的细胞器提高细胞存活率，抑制细胞凋亡[7，13]。本研究发现，TST 促进细胞自噬，抑制OGD 诱导的心肌细胞凋亡，氯喹抑制自噬导致TST 的心肌保护作用丧失，细胞存活率降低，细胞凋亡增多。上述结果表明TST 通过增强自噬抑制细胞凋亡，在心肌细胞损伤中发挥保护作用。

综上所述，桃红四物汤促进细胞自噬，抑制OGD诱导的心肌细胞凋亡，发挥保护作用。