荞麦茎中总酚和总黄酮的提取工艺研究

郭乾城

摘要：以荞麦茎为原料，采用正交试验研究多酚和芦丁的最佳提取工艺。结果表明，采用丙酮为提取剂时多酚和总黄酮的得率最大，提取2次提取率可达93.7%；总黄酮与多酚类物质的最佳提取工艺一致，丙酮体积分数50%、料液比1∶30（g∶mL）、提取温度55℃、提取时间25min；多酚得率为13.87mg/g，总黄酮得率2.05mg/g。

关键词：荞麦茎；多酚；总黄酮；提取工艺

荞麦（buckwheat）是蓼科（polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum）植物，是一种生育期短、耐贫瘠、适应性广泛的杂粮作物，在世界范围内广泛种植[1]。但是长期以来，荞麦仅用于传统食品加工生产，其茎叶被作为饲料和秆肥，甚至丢弃处理，未得到高价值利用[2]。

荞麦含有多酚类、黄酮类等天然活性成分，研究表明植物多酚具有抗肿瘤、抑菌和抗氧化等众多生理活性。以芦丁（rutin）为代表的黄酮类化合物，具有独特的保健功能，可用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血，降低血脂和胆固醇，有抗菌和抗辐射作用；可用于防治高血压、脑溢血、糖尿病、视网膜出血和出血性紫癜等，也可用作食品抗氧化剂和色素。芦丁可直接作为药品，或作为药物的中间体，用于食品和化妆品领域[3-5]。

采用溶剂提取法从荞麦茎中提取具有保健和药用价值的功能成分，优化提取工艺对于荞麦茎的高价值利用具有重要意义。

1 试验与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：荞麦茎，于十月份采自咸阳旬邑县，干燥粉碎后过60目筛。

试验试剂：Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸、芦丁、AlCl3、甲醇、丙酮、乙醇，均为分析纯；20%碳酸钠、5%NaNO2溶液、70%乙醇、10%Al（NO3）3溶液、4%NaOH溶液；芦丁对照品：精密称取10mg芦丁标准品用无水乙醇溶解后，再用60%乙醇定容至50ml容量瓶中。

1.2 试验仪器

仪器设备：752型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HHW-21CU-600电热恒温水槽，上海福玛实验设备有限公司；JYL-C010九阳料理机；震荡仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；离心机，江苏保庆分析设备厂；MHE-150型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ME204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；移液枪。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺

将新鲜荞麦茎自然阴干，粉碎后过60目筛，冰箱4 ℃条件下保存，待用。

1.3.2 总酚含量测定

1）没食子酸标准曲线制作

参考文献[6]并做适当修改。称取0.500g没食子酸，用水溶解，定容至100mL，以此母液配制质量浓度为10、20、30、40、50、60mg/L的系列标准溶液，分别吸取系列标准溶液1mL于10mL离心管中，加入10%Folin-Ciocalteu显色剂5mL，混匀，3-8min内各加入7.5%碳酸钠溶液4mL，混匀，在室温条件下避光放置1h。用紫外-可见分光光度计测定在765nm下的吸光值（A），平行测定3次，绘制标准曲线。

2）样品吸光度测定

准确吸取1mL稀释一定倍数后的试液，转移至10mL离心管中，加入10%Folin-Ciocalteu显色剂5mL，混匀，3-8min内各加入7.5%碳酸钠溶液4mL，混匀，在室温条件下避光放置1h。用紫外-可见分光光度计测定在765nm下的吸光值（A），平行测定3次。

3）总酚含量计算

W为多酚含量（%），c为多酚质量浓度（mg/ mL），v为提取液体积，n为稀释倍数，M为荞麦茎样品质量。

1.3.3 总黄酮含量测定

1）芦丁标准曲线的制作

参考文献[1]并做适当修改。分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL芦丁对照品溶液于25mL容量瓶中，加水至6mL，加入4mL5%的NaNO2，摇匀静置6min后再加入1mL10% Al（NO3）3，摇匀静置6min，再加10ml4%的NaOH，加水至刻度，摇匀后静置15min。在紫外分光光度計510nm处测定其吸光值，平行测定3次。以吸光度（A）为横坐标，浓度（C）为纵坐标，绘制标准曲线。

2）样品吸光度的测定

吸取3mL稀释一定浓度后的提取液置于25mL容量瓶中，步骤同上，平行测定3次。

3）黄酮含量计算

W为黄酮含量（%），c为黄酮质量浓度（mg/ mL），v为提取液体积，n为稀释倍数，M为荞麦茎样品质量。

1.4 提取溶剂的选择

称取4份荞麦茎粉末各0.2g，溶剂分别为乙醇、甲醇、丙酮、水；体积分数65%，料液比1∶20，提取温度55℃，提取时间1h，提取2次；各处理重复3次。

1.5 单因素试验

选定料液比、提取温度、体积分数、提取时间四个可能影响提取效果的因素，分别以总酚、总黄酮得率为考察指标，优选合适的提取条件。

1.5.1 体积分数对总酚、总黄酮提取的影响

称取6份荞麦茎粉末各0.2g，按照料液比1∶20，提取温度55℃，水浴时间1h，提取2次；丙酮体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%；平行处理3次。

1.5.2 料液比对总酚、总黄酮提取的影响

称取6份荞麦茎粉末各0.2g，按照丙酮体积分数 60%，提取温度55℃，水浴时间1h，提取2次；料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35；平行处理3次。

1.5.3 提取温度对总酚、总黄酮提取的影响

称取6份荞麦茎粉末各0.2g，按照丙酮体积分数60%，料液比1∶25，水浴时间1h，提取2次；温度分别为35、45、55、65、75、85℃，平行处理3次。

1.5.4 提取时间对总酚、总黄酮提取的影响

经过多次试验摸索，选择称取5份荞麦茎粉末各0.2g，按丙酮体积分数60%，料液比1∶25，55℃，提取2次；时间分别为2、5、15、25、40min，平行处理3次。

1.6 提取次数的选择

称取4份荞麦茎粉末0.2g，丙酮体积分数60%，料液比1∶25，55℃条件下，15min/次，分别提取1、2、3、4次，各处理重复3次。

1.7 正交试验设计

根据单因素试验结果，选取体积分数（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）四个因素，4因素3水平正交试验设计见表1，分别以总酚、总黄酮得率为响应值，平行3次。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

由图1可知，没食子酸标准曲线方程为y = 0.0093x + 0.0275，R2 = 0.9997。

2.2 芦丁标准曲线

由图2可知，芦丁标准曲线方程为y = 0.0116x -0.0241，R2 = 0.9998。可以看出，芦丁标准曲线的回归性较好，能够较准确地拟合出真实数据。

2.3 提取溶剂的选择

由图3、图4可知，荞麦茎中总酚、总黄酮得率均以丙酮为提取溶剂时得率最高，故选择丙酮作为提取溶剂进行后续试验。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 体积分数对总酚、总黄酮提取的影响

由图5、图6可知，随着丙酮体积分数增加，荞麦茎中总酚、总黄酮的得率均出现先升高后降低的趋势，在丙酮体积分数60%时得率达到最高，故选择丙酮体积分数60%作为正交试验中心条件。

2.4.2 料液比对总酚、总黄酮提取的影响

由图7、图8可知，总酚、总黄酮得率随料液比增加呈现快速增长后趋于平缓，或者有所降低，在料液比1∶25时，二者得率均达到最高。所以，选择料液比1∶25作为后续试验的中心条件。

2.4.3 提取温度对总酚、总黄酮提取的影响

由图9、图10可知，随着温度的升高，总酚和黄酮类化合物的得率均先升高后降低，在提取温度达到55℃时，得率较高。因此，选择55℃作为优化试验的中心温度。

2.4.4 提取时间对总酚、总黄酮提取的影响

由图11、图12可知，在其他条件一定的情况下，15min内随着浸提时间的增加，荞麦茎总酚和总黄酮的得率逐渐增加，15min以后有所下降或者基本持平，故选择15min作为优化试验的中心提取时间。

2.5 提取次数的选择

由图13、图14可知，第1次提取时，荞麦茎中酚类和黄酮类物质溶出率较低，造成此类生物活性物质的大量浪费，进行2次提取后，二者提取率均可达93.7%以上。提取次数增加可以提高得率，但提高幅度很小，综合考虑经济及环保因素，选择提取2次较为合适。

2.6 正交优化试验结果

正交优化试验设计与结果见表2，K分析针对总酚含量，T分析针对总黄酮含量，所用方法均为极差分析。

荞麦茎中总酚得率的影响因素是A>B>C>D，最优条件是A1B3C2D3。即：丙酮体积分数对总酚得率的影响最大。正交试验得出的最优条件是：选择丙酮为提取剂，提取2次，丙酮体积分数50%、料液比1∶30、提取温度55℃、提取时间25min。总黄酮得率的影响因素是B>C>A>D，最优条件为A1B3C2D3。即：料液比对总黄酮得率的影响最大，正交最优条件与总酚相同。

3 结论

采用溶剂法提取荞麦茎中的多酚和黄酮类物质，以丙酮为溶剂对于荞麦茎中酚类和黄酮类物质的浸出效果最好，提取2次多酚和总黄酮的提取率即可达到93.7%以上。各因素对多酚得率的影响大小依次为：体积分数>料液比>提取温度>提取时间；各因素对总黄酮得率的影响大小依次为：料液比>提取温度>体积分数>提取时间。正交试验优化的多酚和黄酮类物质提取工艺参数为：丙酮体积分数50%、料液比1∶30、提取温度55℃、提取时间25min，在此条件下，多酚提取得率达13.87mg/g，总黄酮提取得率为2.05mg/g。该提取工艺，多酚和黄酮类物质得率高，工艺稳定，可为荞麦茎资源的深度利用提供理论依据。

参考文献

[1] 臧小云，刘丽萍，蔡庆生.不同供氮水平对荞麦茎叶中黄酮含量的影响[J].南京农业大学学报，2006，29（3）：28-32.

[2] 李白存.响应面法优化荞麦茎中芦丁的提取工艺[J].化学与生物工程，2016，33（10），39-44

[3] 周小理，周一鸣，田呈瑞.荞麦芦丁提取纯化及定量分析方法的研究进展[J].食品工业，2007，（3）：20-22.

[4] 穆志新，田翔，周建萍，等.高效液相色谱法测定荞麦中芦丁含量[J].山西农业科学，2015，43（11）：1408-1410.

[5] 雷昌贵，孟宇竹，刘蒙佳等.食品中多酚類化合物测定方法研究进展[J].粮油食品科技，2007，15（4）：61-63.

[6] 李健，杨昌鹏，李群梅等.植物多酚的应用研究进展[J].广西轻工业，2008，24（12）：1-3+9.