兰坪虫草多糖组分分析及免疫活性研究

柯迎妹 周树波 葛 锋,2 虞 泓

(1. 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2. 昆明市虫草生物资源开发利用工程技术研究中心，云南 昆明 650100；3. 云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南 昆明 650091)

兰坪虫草(Ophiocordycepslanpingensis)为近年来发现的虫草新种，主要成分为虫草多糖、核苷类、甾醇类、氨基酸等[1]，具有显著的抗疲劳活性[2]，对小鼠肾功能衰竭和肺纤维化有明显缓解作用[3-4]。临床上，诸如慢性肾功能衰竭、肺纤维化等疾病均与免疫系统失调相关[5-6]。近年来，作为免疫调节剂，多糖在治疗疾病和调节免疫力方面表现出独特的优势[7-8]。其活性与其固有的理化性质相关，包括分子量、官能团以及单糖组分等[9]。

试验拟从兰坪虫草菌粉中提取多糖，分析其分子量、单糖组分及官能团特征，并参照《保健食品检验与评价技术规范》中提高免疫力功能的检测方法，明确兰坪虫草多糖(OLP)增强免疫力功能的作用，为兰坪虫草的进一步研究开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

兰坪虫草菌种：经云南大学虞泓教授鉴定为线虫草科线虫草属，使用部位为兰坪虫草菌丝体，云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室；

BALB/c小鼠：SPF级，体重18～20 g，生产许可证号为SCXK(辽)2015-0001，辽宁长生生物技术有限公司；

三氟乙酸(TEA)、氯仿：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

环磷酰胺：分析纯，江苏恒瑞医药股份有限公司；

刀豆蛋白(ConA)：美国Sigma公司；

绵羊红细胞(SRBC)：中国科学院上海细胞库；

印度墨汁：北京笃信精细制剂厂；

Trizol试剂盒、逆转录试剂盒：日本Takara生物技术公司；

细胞周期试剂盒：北京Solarbio生物科技有限公司；

实时荧光定量聚合酶链式反应引物：生工生物工程上海股份有限公司。

1.2 仪器与设备

低速恒温离心机：ST16R型，美国ThermoFisher Scientific公司；

超声微波组合反应装置：XO-SM100型，南京先欧仪器制造有限公司；

凝胶色谱仪：PL-GPC 50型，美国安捷伦科技有限公司；

气质联用仪：GC7890型，美国安捷伦科技有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：8700型，美国ThermoFisher Scientific公司；

酶标仪：MMC-GZ-010型，美国ThermoFisher Scientific公司；

紫外分光光度计：ΜLtrospec 2100 pro型，美国Amersham Biosciences公司；

二氧化碳培养箱：E191IR型，美国金西盟公司；

血液分析仪：LH750型，美国贝克曼库尔特有限公司；

病理学切片机：HM325型，美国ThermoFisher Scientific公司；

实时荧光定量PCR仪：LightCycler 96型，瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 兰坪虫草多糖的提取 将兰坪虫草菌粉与超纯水按料液比1∶10 (g/mL)混合，沸水浸提2 h，然后进行超声波提取(160 W，45 ℃，30 min)，2 500 r/min离心15 min，上清液旋蒸至原体积的25%，用无水乙醇以体积比1∶4进行醇沉过夜，4 000 r/min离心10 min，取沉淀溶于适量体积的超纯水，通过Savage方法[10]去除蛋白，并透析2 d，冷冻干燥即得兰坪虫草多糖。

1.3.2 兰坪虫草多糖的测定

(1) 分子量：采用凝胶渗透色谱法。色谱柱：phenomenex PolySep-GFC-P 4000，7.80 mm×300 mm，进样量20 μL，柱温35 ℃。

(2) 单糖组成及含量：采用GC-MS法。色谱柱为HP-5气相色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，进样量1 μL；初始温度110 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升温至160 ℃，再以2 ℃/min升温至230 ℃，最后以5 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。

(3) 官能团特征分析：采用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)，扫描频率4 000～400 cm-1。

1.3.3 动物造模、分组及给药 试验前24 h对小鼠禁水，不禁食。次日将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为空白组、模型组、兰坪虫草多糖低剂量组(0.3 g/kg，OLPL组)、兰坪虫草多糖中剂量组(0.5 g/kg，OLPM组)、兰坪虫草多糖高剂量组(1.0 g/kg，OLPH组)。除空白组外，其他小鼠根据体重每天腹腔注射环磷酰胺(40 mg/kg)，连续4 d，建立小鼠免疫抑制模型。造模后，使用相应的药物对各组小鼠进行灌胃，空白组和模型组给予等体积的生理盐水。试验小鼠每天灌胃一次，连续30 d。

1.3.4 脾脏指数及胸腺指数的测定 给药结束后，处死小鼠，取小鼠脾脏和胸腺，称重。脾脏或胸腺质量和体质量比值即为脾指数和胸腺指数。

1.3.5 脾脏组织病理学检测 将脾脏组织固定于10%的中性福尔马林，乙醇梯度脱水，二甲苯显色透明，石蜡包埋并切片(厚度4 μm)，然后对组织切片进行苏木精—伊红(H&E)染色，光学显微镜下观察。

1.3.6 碳粒廓清试验 末次给药后，将印度墨汁(10 mL/kg)按体重注入小鼠尾静脉，并计时。分别于第2，10 min时从内眦静脉丛取血20 μL，立即加入 0.1%的Na2CO3溶液2 mL。测定600 nm处光密度值，以Na2CO3溶液为空白对照。称量脾脏、肝脏质量，按式(1)、(2)计算吞噬指数。

(1)

(2)

式中：

α——吞噬指数；

m1——小鼠体质量，g；

m2——肝质量，g；

m3——脾质量，g；

K——廓清指数；

OD1——2 min时的光密度值；

OD2——10 min时的光密度值；

t1——2 min；

t2——10 min。

1.3.7 抗体生成细胞检测 采用Jerne改良玻片法[11]进行检测并计数溶血空斑数，抗体生成细胞数用溶血空斑数/106脾细胞表示。

1.3.8 ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞转化试验 采用MTT法[12]。

1.3.9 细胞周期的测定 末次给药后处死小鼠，无菌取脾，制备脾淋巴细胞悬液，加入24孔培养板中，每孔500 μL，37 ℃培养24 h，取每孔细胞于4 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入1 mL预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，轻轻吹打均匀后，继续离心5 min，弃上清，重复上述操作两次。加入70%冰乙醇1 mL混匀，于4 ℃冰箱过夜。根据细胞周期检测试剂盒说明书配制染色液，4 ℃冰箱保存。取样品0.5 mL，轻轻吹打，37 ℃避光培养30 min，过200目尼龙膜，用流式细胞仪进行检测，每个样品计数1×104细胞。

1.3.10 细胞因子基因表达水平检测 使用Trizol试剂盒提取小鼠脾组织RNA，逆转录成cDNA，对目标基因进行实时荧光定量PCR，反应体系20 μL，反应扩增程序：95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共42个循环。引物序列如表1所示。每个样品重复3次，以β-actin作内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算IL-2和IL-10的基因表达水平。

2 结果与分析

2.1 结构表征

试验测得OLP分子量为3.2×105Da。由图1、表2可知，木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、岩藻糖、果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸的保留时间分别为20.006，20.520，21.083，22.995，23.449，29.121，29.736，29.983，30.345，31.956 min，OLP主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖组成，且摩尔比为13.38∶5.31∶81.31。

表1 qRT-PCR引物序列信息

图1 单糖标准品和兰坪虫草多糖的GC-MS色谱图

表2 兰坪虫草多糖的单糖组分及含量

由图2可知，O—H/N—H的伸缩振动在3 431.59/3 386.17 cm-1处有两个连续的强且宽的吸收带，C—H和C—O—C的伸缩振动峰分别为2 929.43，1 024.07 cm-1，这些区域的吸收峰为糖类特征峰[13-14]。1 650.59 cm-1处的吸收峰是糖分子中羰基CO的伸缩振动峰，即多糖中含有糖醛酸，为酸性多糖；1 419～1 200 cm-1处是羧基的C—O伸缩振动引起的吸收峰；1 200～1 000 cm-1处的吸收峰表示兰坪虫草多糖的糖环构型可能为吡喃环[15]；950～800 cm-1处为异头质子的C—H弯曲振动峰，其中865.01 cm-1处的异头C—H振动峰说明具有α-半乳糖，810.43 cm-1处的峰则进一步证实α-甘露糖是兰坪虫草多糖的单糖成分之一[16]。

图2 兰坪虫草多糖的FT-IR图

2.2 对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

脾脏和胸腺作为外周免疫器官和中枢免疫器官，是参与免疫反应的主要场所。免疫器官指数的变化可以初步反映药物对免疫器官以及免疫调节是否具有影响[17]。由表3可知，模型组小鼠脾指数和胸腺指数均显著低于空白组(P<0.05)，表明模型组小鼠免疫器官受损；兰坪虫草多糖给药组小鼠的脾指数和胸腺指数均高于模型组，其中OLPH组的升高趋势明显(P<0.05)。故兰坪虫草多糖可以提高免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数，改善环磷酰胺引起的小鼠免疫器官萎缩，从而提高小鼠的免疫功能。

表3 兰坪虫草多糖对小鼠免疫器官指数的影响†

2.3 对小鼠脾脏组织的影响

由图3可知，空白组小鼠脾脏白髓(WP)与红髓(RP)边缘分界清晰，白髓由脾小体和动脉周围淋巴鞘组成，淋巴细胞密集，红髓部分的脾索和脾窦结构清晰。模型组的脾小体萎缩、形状不规则，淋巴细胞离散且排列疏松，红髓充血明显。兰坪虫草多糖给药组小鼠脾脏的淋巴细胞数量呈剂量依赖性增加，脾小体结构逐渐恢复，红髓区域充血现象得到改善。说明兰坪虫草多糖可能通过增加淋巴细胞数量，逐步恢复脾小体结构，改善红髓区域充血来提高机体免疫力。

WP. 脾脏白髓 RP. 脾脏红髓

2.4 对小鼠碳粒廓清的影响

由表4可知，与空白组相比，模型组小鼠吞噬廓清异体颗粒的能力显著降低(P<0.01)；与模型组相比，兰坪虫草多糖治疗组小鼠吞噬廓清异体颗粒的能力依赖剂量有效提高。说明兰坪虫草多糖能增强免疫低下小鼠单核—巨噬细胞的吞噬能力，改善小鼠的非特异性免疫，从而调节免疫功能。

表4 兰坪虫草多糖对小鼠碳粒廓清的影响†

2.5 对小鼠抗体生成细胞的影响

抗体生成细胞试验用于体外测定生成IgM、IgG等抗体的细胞数，小鼠被绵羊红细胞免疫后，B淋巴细胞产生抗体，与适量的SRBC混合后，在补体的参与下可以溶解抗体分泌细胞周围的绵羊红细胞，生成空斑，空斑数量反映了机体的体液免疫功能[18]。由表5可知，与空白组相比，模型组溶血空斑数显著降低(P<0.01)；与模型组相比，兰坪虫草多糖给药组的溶血空斑数随给药剂量的增加逐渐升高，OLPM组和OLPH组的增加效果显著(P<0.01)。说明兰坪虫草多糖可以促使小鼠抗体生成细胞的产生，并诱导抗体的释放，在一定程度上增强机体的体液免疫功能。

表5 兰坪虫草多糖对小鼠抗体生成细胞的影响†

2.6 对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响

ConA诱导T淋巴细胞的增殖是一种典型的细胞免疫，已被广泛用作淋巴细胞反应性研究中的免疫参数[19]。由表6可知，与空白组相比，模型组小鼠T淋巴细胞增殖能力显著降低(P<0.01)。与模型组相比，OLPM组和OLPH组小鼠T淋巴细胞的增殖能力均显著增高(P<0.01)，表明兰坪虫草多糖可以改善环磷酰胺对小鼠ConA诱导脾淋巴细胞的增殖反应造成的抑制，具有明显增强机体特异性细胞免疫功能的作用。

2.7 对小鼠脾脏T淋巴细胞周期的影响

细胞周期是连续分裂的真核细胞的增殖周期，可分为分裂间期和分裂期，分裂间期包括G0、G1、S和G2期，其中在S期进行染色体复制[20]。由表7可知，与空白组相比，模型组小鼠T淋巴细胞在S期的比例降低(P<0.05)，说明环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠T淋巴细胞的细胞周期S期受到抑制，细胞增殖能力减弱。与模型组相比，兰坪虫草多糖各组小鼠T淋巴细胞S期比例均有所增加，其中OLPH组的差异显著(P<0.05)，表明兰坪虫草多糖对T淋巴细胞周期有一定的影响，能缓解环磷酰胺对小鼠T淋巴细胞进入S期的抑制作用，促进DNA合成和细胞增殖，进一步说明兰坪虫草多糖对机体免疫力的提升可能是通过增加T淋巴细胞的数量来实现。

表6 兰坪虫草多糖对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验的影响†

表7 兰坪虫草多糖对小鼠脾脏T淋巴细胞周期的影响†

2.8 对小鼠IL-2和IL-10基因表达的影响

IL-2是Thl型细胞因子，与T淋巴细胞的细胞周期从G1期向S期过渡相关，可以促使T淋巴细胞增殖[21]。由表8可知，与空白组相比，模型组小鼠脾脏中IL-2基因表达量明显降低(P<0.01)，使用OLP后可以显著增加IL-2基因的表达量(P<0.01)，兰坪虫草多糖可有效提高免疫抑制小鼠细胞因子IL-2的基因表达水平。结合细胞周期的检测结果可知，兰坪虫草多糖可能通过增加IL-2的分泌影响T淋巴细胞的细胞周期，促使DNA合成和细胞增殖。

IL-10由多种细胞产生，包括Th2细胞和Th3细胞，是一种与免疫相关的多效性细胞因子，具有免疫调节特性的CD41 T细胞可通过完全或部分依赖IL-10的机制起作用[22-23]。而兰坪虫草多糖还可以增加IL-10的基因表达水平，OLPM组和OLPH组的IL-10基因表达量较模型组显著升高。

表8 兰坪虫草多糖对小鼠IL-2和IL-10基因表达的影响†

3 结论

从兰坪虫草菌粉中提取多糖(OLP)，并对其进行单糖组分和官能团特征分析，表明OLP主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖构成，其摩尔百分比为13.38∶5.31∶81.31，可能是含有糖醛酸和吡喃环的酸性多糖。对小鼠免疫力的影响研究表明，OLP可以改善免疫抑制模型小鼠免疫器官受损情况，提高非特异性免疫、体液免疫以及细胞免疫，初步明确兰坪虫草多糖具有改善免疫力的功能。后续将对兰坪虫草多糖调节免疫活性的机理进行研究，为兰坪虫草多糖作为保健食品佐剂的开发和应用提供依据。