荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

陈夏鑫, 陈振林, 帅 良, 段振华, 商飞飞, 宋慕波,*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西 贺州 542899）

荸荠（Eleocharis dulcis）又名马蹄，原产于我国南部，为莎草科浅水草本植物。荸荠球茎膨大，是其主要的食用部位，因其口感爽脆、亦果亦蔬的特点自古有“江南人参”的美誉[1]。荸荠球茎生长于浅水污泥之中，削皮困难，因此方便卫生的鲜切荸荠产品深受消费者欢迎。荸荠外皮较厚，带皮贮藏相对容易，但经切削处理的荸荠极易发生黄化。以往的研究表明，鲜切荸荠的黄化与黄酮类物质的积累有关。Pan 等[2]在黄化的鲜切荸荠表面组织中分离得到了柚皮素和圣草酚两种黄酮类物质。本课题组在研究中发现，随着贮藏时间的延长，鲜切荸荠表面组织中柚皮素和圣草酚的含量快速提高，与荸荠表面黄化程度成正相关[3]。查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）是苯丙烷代谢过程中的关键酶之一，在黄酮的生物合成过程中起关键作用。植物中查尔酮在CHI 的催化下形成二氢黄酮类化合物，进而推动下游黄酮类物质的合成[4]。与其他苯丙烷代谢途径关键酶编码基因类似，CHI 的表达水平受到外界环境的调控，如强光、干旱和机械损伤等[5]。研究发现，机械伤信号能够诱导植物CHI 的表达，从而导致更多新酶合成[6]。同时，研究发现银杏[7]和水稻[8]等植物的CHI 表达与类黄酮物质的积累关系密切。目前针对CHI 基因的研究多集中在高等植物叶片和花中，其在植物茎中，特别是在茎组织响应机械伤过程中的表达调控研究较少。目前仍未在荸荠中克隆到CHI 基因。本研究利用cDNA 末端快速扩增（RACE）技术克隆荸荠CHI 基因全长，对其序列特征进行生物信息学分析，利用荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术研究其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达特征，以期为鲜切荸荠黄化控制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

新鲜荸荠购于广西贺州市八步区农产品市场，运回实验室经清洗，挑选大小均一、无机械损伤和病虫害的果实，去皮后横切成厚度为0.5 cm 的圆片，样品分成两组，对照组在清水中浸泡10 min，处理组在10 mmol·L-1水杨酸水溶液中浸泡10 min，样品晾干后置于塑料托盘中用0.02 mm 厚聚乙烯膜包装，于10 ℃下贮藏。在贮藏 0、2、4、6、8 d 分别取样，将样品放入-80 ℃超低温冰箱保存，用于后续基因克隆和表达分析。

植物RNA 提取试剂盒：华越洋生物科技（北京）有限公司产品；SMARTer RACE 5′/3′Kit RACE 试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix 荧光定量酶、PrimeScriptTM RT reagent Kit 反转录去基因组试剂盒：均为日本Takara 公司产品；溴化乙锭：生工生物工程（上海）股份有限公司产品；DNA 凝胶回收试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司产品；琼脂糖西班牙 Biowest 公司；Tris、乙醇、EDTA-Na2：均为分析纯，国药集团药业股份有限公司产品。

1.1.2 仪器与设备

SQ510C 型立式压力蒸汽灭菌锅，5424 R 型高速冷冻离心机，G-1000 型 PCR 仪，DYY-6D 型电泳仪，DYCP-31DN 型水平电泳槽，ZF-368 型凝胶成像系统，K5600 型超微量分光光度计，CFX Connect 型荧光定量PCR 仪。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取

采用植物RNA 提取试剂盒提取荸荠总RNA，具体方法按照说明书进行。得到RNA 后利用K5600 型超微量分光光度计测定其纯度和含量，RNA 样品保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于反转录等后续试验。

1.2.2 基因克隆

3′RACE-cDNA 和 5′RACE-cDNA 的合成具体操作按照 SMARTer RACE 5′/3′ Kit RACE 试剂盒进行。根据之前从荸荠转录组数据中得到的CHI 基因片段设计 3′RACE 和 5′RACE 引物（表 1）。PCR 产物经回收、连接（pRACE vector）、转化（Stellar 感受态细胞）、重组子筛选及菌液PCR 鉴定后，委托华大基因科技股份有限公司进行测序。

表1 基因克隆和表达分析所用引物Table 1 Primers used for cloning and expression analysis

1.2.3 基因生物信息学分析

采用 NCBI 中的 BLASTN、BLASTP 程序进行核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性比较；ORF finder 程序寻找开放阅读框；采用ProtParam Tool 分析蛋白质理化性质；采用Conserved Domains 分析氨基酸序列的保守区域；采用TargetP 1.1 Server 进行氨基酸序列导肽的分析；采用SignalP 4.0 Server 预测蛋白的信号肽；采用Post Prediction 和SubLocv 1.0 进行蛋白亚细胞定位信号预测；ProtScale 以Hphob./Kyte&Doolittle 算法进行亲疏水性预测；使用NetPhos 2.0 Server 预测蛋白质序列的磷酸化位点；使用ExPaSy-SOPMA 软件分析蛋白质的二级结构；使用ClustaW 1.83 软件进行多重序列比对；采用Mega 5 软件进行统进化树构建；采用SWISS-MODEL 预测蛋白质三级结构。

1.2.4 酶活性测定

CHI 活性的测定参照姜悦等[9]的方法略作调整。取鲜切荸荠组织表层1.0 g，加入5 mL 50 mmol·L-1缓冲液（pH 7.5，内含 50 mmol·L-1抗坏血酸钠、10 mmol·L-1DTT 和0.1%Triton X-100），冰浴中研磨。混合物转移至 50 mL 离心管，于 4 ℃下 12 000 r·min-1离心 20 min，所得上清为粗酶液。取0.4 mL 粗酶液，加入4 mL Tris-HCl 缓冲液（50 mmol·L-1、pH 7.5，内含 7.5 mg·mL-1牛血清蛋白和 50 mmol·L-1NaHSO3），1 mg·mL-1查尔酮溶液100 μL 引发反应，45 ℃恒温水浴中保温30 min，最后加入 6 mol·L-1盐酸（2 mL）终止反应。对照反应液中的粗酶液由蒸馏水代替。在381 nm 波长处测定吸光值，以每分钟OD 变化0.01 为一个CHI活性单位(U)，酶活性单位为U/(g FW)。

1.2.5 基因表达分析

根据获得的CHI 基因序列利用Primer 5.0 设计定量PCR 特异引物（表1）。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit 去基因组及反转录试剂盒合成Q-PCR 的模板cDNA，操作方法见说明书。参考Takara 公司的SYBR Green qPCR Master Mix 说明书进行Real-time PCR 扩增。利用2—△△Ct方法计算表达量。各样品的表达量均为3 次生物重复的平均值。

1.2.6 数据处理

采用Excel 和SPSS 数据处理软件进行统计分析，结果用3 次重复的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 荸荠CHI 基因的克隆

在鲜切荸荠转录组数据的差异表达基因中筛选得到1 条与其他植物CHI 基因序列同源性较高的mRNA 序列片段。NCBI 的 BLASTN 比对结果显示，该片段与多种植物的CHI 基因mRNA 序列相似度在75%以上，其中与水稻（Oryza sativa，XM_015772801）和黑麦（Secale cereale，KC788194）CHI 基因的 mRNA序列同源性最高。利用该片段设计3′ RACE 和5′RACE 引物，进行PCR 扩增后获得3′和5′端序列分别约为450 bp 和750 bp（图1 A）。将片段回收后进行测序分析发现3′端序列长度为366 bp，包含了3′非翻译区（3′UTR）及 Poly A 结构；5′端序列长度为 747 bp 包含了 5′非翻译区（5′UTR）。同时，根据拼接后获得的cDNA 全长序列设计引物，以荸荠基因组为模板，克隆得到了编码区DNA 序列全长，该序列长度为1 182 bp（图 1B）。

将所得全长cDNA 序列使用ORF Finder 在线软件进行分析，发现克隆得到的CHI 基因cDNA 全长为1003bp，含有一个744bp 的最大开放阅读框（ORF）、131 bp 的 5′UTR 区、130 bp 的 3′UTR 区及 31 bp 的Poly A 结构，终止密码子为TGA。将该cDNA 全长序列在NCBI 上进行比对，发现该序列与水稻和黑麦的CHI 基因相似度较高，为76%。因此，可证明已经克隆获得荸荠CHI 基因，将此基因命名为CwCHI，其GenBank Accession Number 为 MG719238。CwCHI编码区DNA 全长 1 182 bp，与cDNA 比对发现，CwCHI的DNA 中有3 个内含子和4 个外显子，其分布如图2 所示。

2.2 CwCHI 生物信息学分析

CwCHI编码蛋白由247 个氨基酸组成。经预测，其分子量为26.410 kD；理论等电点为4.89；分子式为C1197H1852N302O357S7；总原子数为 3 715 个。CwCHI蛋白中最多的氨基酸是丙氨酸（Ala）占12.1%。蛋白整体亲水指数（GRAVY）为0.058，脂溶指数为86.56。

利用 NCBI 的 Blast p 和 Conserved domains 进行预测发现，CwCHI蛋白属于Chalcone_3 super family超家族。CwCHI蛋白含有4 个酪蛋白激酶Ⅱ识别位点，分别位于 14～17、28～31、136～139、176～179；2 个蛋白激酶 C 识别位点分别位于 78～80、118～120；以及2 个 N-豆蔻酰化位点分别位于 48～53、207～212。TMPred 软件预测显示，CwCHI蛋白分别有两个由内到外（46～63,158～174）和由外到内（37～56,157～173）的跨膜区域。使用在线软件ProScale 预测发现CwCHI蛋白疏水区域与预测的跨膜区域基本一致（图 3）。

CwCHI蛋白的二级结构以α-螺旋为主，占38.06%，其他结构中无规则卷曲占33.6%，延伸链占19.84%，β-折叠结构占8.5%。采用Swiss-model 以系统自动匹配南极毛草为模板（5yx4.1.A）对CwCHI蛋白进行同源建模（图4），CwCHI的三级结构中α-螺旋是最明显的结构组件。

通过与其他物种CHI 型蛋白进行多重比对发现，CHI 氨基酸序列较为保守（图5），尤其是组成活性位点的氨基酸残基的保守程度更高，表明CHI 作为植物黄酮生物合成途径中关键酶，在进化的过程中保持了较高的遗传稳定性。与其他Ⅰ型CHI 蛋白类似，在决定底物偏好性的第201 位氨基酸为Ser。采用MEGA 5 软件的Neighbor-Joining 法构建系统进化树，CwCHI与油棕榈和菠萝的CHI 蛋白亲缘关系较近（图 6）。

（2）星号标注的氨基酸残基参与活性位点的组成；三角符号标注的氨基酸残基参决定底物的偏好性。

2.3 CwCHI 基因在荸荠不同组织中的表达分析

黄酮的合成在荸荠的不同组织中广泛存在，本研究采用荧光定量PCR 技术分析CwCHI基因在根、叶、荸荠皮和荸荠肉中的表达特征。结果表明，CwCHI基因在4 个组织中均有表达，其中荸荠皮中的表达水平最高，而在荸荠肉的表达最低（P＜0.05）（图7）。

2.4 鲜切荸荠黄化过程中CHI 活性变化及CwCHI的表达分析

水杨酸处理能够显著抑制鲜切荸荠的黄化。鲜切荸荠在贮藏过程中，对照组CHI 活性呈上升趋势，在贮藏4 d 后酶活性快速提高。10 mmol·L-1水杨酸处理能够显著抑制鲜切荸荠CHI 活性的上升（图8 A）。

通过表达分析发现，贮藏过程中对照组CwCHI的表达水平快速提高，2 d 时CwCHI表达量是0 d 的40.6 倍，之后表达量继续升高，贮藏6 d 后表达量逐渐下降，在8 d 时CwCHI基因表达水平仍显著高于0 d（P＜0.05）（图 8 B）。水杨酸处理组CwCHI的表达量在贮藏过程中各时间点均显著低于对照组（P＜0.05）（图8 B）。

3 讨论与结论

鲜切荸荠黄化与传统多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）参与的酶促褐变不同，苯丙烷代谢中间产物柚皮素和圣草酚的积累是导致表面黄化的主要原因[10]。苯丙烷代谢途径中关键酶编码基因的表达受多种环境因素的调控[5]。以往研究表明，伤信号能够诱导CHI 的表达，促使新酶合成，从而导致植物组织中黄酮的积累[6,11]。因此，鲜切荸荠贮藏期间CHI 活性变化及其编码基因表达的调控与黄化现象可能存在密切关系。本研通过克隆荸荠CHI 基因全长，并研究其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达模式，为揭示荸荠黄化的机理和寻找抑制黄化的方法奠定基础。

由于CHI 与观赏植物花色素的形成关系密切，因此在多种花卉中已经克隆得到了CHI 基因。吴彦庆等[12]在芍药中克隆得到的CHI 基因，其cDNA 编码区长度为898 bp。桂花中克隆得到的OfCHI基因编码区长度为747 bp，可编码248 个氨基酸[13]。本研究在荸荠转录组数据中发现了1 个与其他植物CHI 基因同源性较高的基因片段，通过RACE 技术从荸荠中克隆得到其cDNA 全长序列和全长DNA 序列。该基因mRNA 全长为1 003 bp，有一个长度为744 bp的开放阅读框，可编码247 个氨基酸，将其命名为CwCHI。CwCHI编码区对应 DNA 长度为 1 182 bp，其中有3 个内含子区域，内含子和外显子的交界序列均符合GT-AG 规则。CHI 基因在植物界存在CHIⅠ和CHIⅡ两种类型，其中CHIⅠ存在于葡萄、拟南芥和大麦等多种植物中，而CHIⅡ则存在于豆科植物中[14-15]。CHIⅠ只能以柚皮素查尔酮为底物，而CHI Ⅱ则可以同时以异甘草素和柚皮素查耳酮为底物[16]。豆科植物中CHI Ⅱ具有4 个外显子和3 个内含子的典型结构[17-18]。本研究克隆得到的CwCHI虽然也具有4 个外显子和3 个内含子，但其蛋白保守域却与CHIⅠ型相同，决定底物类型的Ser-201 也与其他CHIⅠ型相同，而在CHIⅡ型中该残基为Thr[19]。

CHI 基因的表达水平与植物黄酮类物质的合成关系密切，其表达有明显的组织特异性，且在不同物种中的表达模式存在差异。在桂花中，CHI 基因在茎中的表达最高，而在花中的表达最低[13]。在脐橙中，CHI 基因的表达在根中最高，在叶中最低[20]。通过对荸荠不同组织CwCHI的表达分析发现，其在根、叶、荸荠皮和荸荠肉中均有表达，而在荸荠肉中的表达水平最低。

鲜切果蔬受到机械损伤后，受伤组织苯丙烷代谢途径关键基因的表达水平快速提高，这是植物对机械损伤响应的重要表现[21]。本研究发现，在贮藏初期对照组鲜切荸荠CHI 的酶活性与CwCHI表达水平较低，但随着贮藏时间的延长均呈快速上升趋势，表现出明显的相关性。Peng 等[22]研究发现，水杨酸处理能明显抑制鲜切荸荠的黄化，但其抑制黄化的机理仍不清楚。在本研究中，10 mmol·L-1水杨酸处理显著抑制了鲜切荸荠贮藏过程中CHI 的酶活性和CwCHI的表达。以上结果表明，鲜切荸荠贮藏过程中CHI 活性和CwCHI表达水平的提高与其表面黄化关系密切，水杨酸处理对CHI 活性和CwCHI表达的抑制可能是其延缓鲜切荸荠黄化的原因。