吴茱萸碱对缺氧微环境下胆囊癌细胞增殖及HIF-1α、VEGF表达的影响

徐智 刘春燕 温娟 刘绍华

[摘要] 目的 探讨吴茱萸碱对缺氧微环境下胆囊癌细胞（GBC-SD）增殖及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 以3%O2、5%CO2模拟缺氧微环境，将GBC-SD分为正常对照组、缺氧组、吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组，分别置于常氧和缺氧微环境下培养。MTT法检测各组12、24、48、72、96 h细胞增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染流式法检测各组细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达状况。 结果 MTT结果显示：12 h三組间细胞的光密度值比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;24、48、72、96 h缺氧组细胞的光密度值低于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）;24、48、72、96 h吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组细胞的光密度值低于缺氧组，差异有统计学意义（P < 0.05）。流式细胞结果显示：缺氧组细胞凋亡率高于正常对照组（P < 0.05）;吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组的细胞凋亡率高于正常对照组和缺氧组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组细胞内HIF-1α、VEGF的蛋白表达均低于正常对照组和缺氧组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 吴茱萸碱能够抑制缺氧微环境下GBC-SD增殖，并促进细胞凋亡，这可能与吴茱萸碱抑制肿瘤细胞内的HIF-1α和VEGF的表达有关。

[关键词] 吴茱萸碱;胆囊癌;缺氧诱导因子1α;血管内皮生长因子

[中图分类号] R735.8          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0030-04

Effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells and the expression of HIF-1α and VEGF in anoxic microenvironment

XU Zhi1   LIU Chunyan2   WEN Juan1   LIU Shaohua3

1.Department of Clinical Medicine， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang   337000， China; 2.Department of Nursing， Pingxiang Health Vocational College， Jiangxi Province， Pingxiang   337000， China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery， Pingxiang People′s Hospital， Jiangxi Province， Pingxiang   337000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of evodotaxine on the proliferation of gallbladder carcinoma cells （CBC-SD） and the expression of hypoxia-inducing factor 1α （HIF-1α） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in GBC-SD in anoxic microenvironment. Methods Using 3%O2 and 5%CO2 to simulate anoxic microenvironment， CBC-SD cells were divided into normal control group， hypoxic group and evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxic group， they were cultured in normal and hypoxic microenvironments. MTT assay was used to detect the proliferation of 12， 24， 48， 72 and 96 h cells in each group. Annexin V-FITC/PI double staining flow method was used to detect apoptosis in each group. HIF-1α， VEGF protein expression was detected by Western blot. Results MTT results showed that there was no statistically significant difference in the optical density values between the three groups at 12 h （P > 0.05）. At 24， 48， 72 and 96 h， the optical density of the hypoxia group was lower than that of the normal control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. At 24， 48， 72， and 96 h， the light density value of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was lower than that of the hypoxia group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of hypoxia group was higher than that of normal control group （P < 0.05）. The apoptosis rate of evodotaxine （100 μg/mL） + hypoxia group was higher than that of normal control group and hypoxia group， and the difference was statistically significant （all P < 0.05）. The protein expression of the HIF-1α， VEGF in the cells of the evodotaxine （100 μg/mL） + anoxic group was lower than that of the normal control group and the hypoxic group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion Evodotaxine can inhibit the proliferation of GBC-SD cells in gallbladder cancer under hypoxic microenvironment and promote apoptosis， which may be related to evodotaxine′s inhibition of HIF-1α and VEGF expression in tumor cells.

[Key words] Evodiamine; Gallbladder carcinoma; Hypoxia-inducing factor 1α; Vascular endothelial growth factor

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来该病的发生率和死亡率均有明显上升趋势[1-2]。长期以来，胆囊癌因其发病隐匿、病情进展迅速、手术切除率较低等特点，使该病在早期诊断及治疗方面没有取得有效进展，加之手术及放化疗的效果不理想，患者预后不佳[3]。因此，急需寻找一种有效治疗胆囊癌的方法。

吴茱萸碱是中药吴茱萸的有效成分，它不仅能调节免疫，同时也能抑制肿瘤增殖，促进肿瘤凋亡[4-5]，但其具体的抗肿瘤分子机制仍不明确。本研究采用人胆囊癌细胞（GBC-SD）作为研究对象，探讨吴茱萸碱对GBC-SD增殖的影响及相关分子机制，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料与细胞培养

DMEM培养基（Hyclone，货号：SH30022.01）;胎牛血清（GIBCO，货号：42F7180K）;Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（Biolegend）;血管内皮生长因子（VEGF）兔抗人多克隆抗体（Abclonal，货号：A2556）;缺氧诱导因子1α（HIF-1α）鼠抗人多克隆抗体（Abcam，货号：Ab113642），胰酶（Genview，货号：89040101100），MTT（Genview，货号：298-93-1）。荧光倒置显微镜（日本Nikon），流式细胞仪（美国BD），酶标仪（美国Thermo Labsystems），化学发光仪（上海勤翔）。GBC-SD（购于中国科学院细胞库）置于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃饱和湿度、含5%CO2的常氧孵箱中培养;以37℃饱和湿度，含3%O2、5%CO2的条件模拟肿瘤细胞缺氧环境。

1.2 MTT法检测GBC-SD增殖能力

分组：正常对照组（常氧组），缺氧组（模拟缺氧环境），吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组。取对数生长期的GBC-SD悬液，以0.8×104个/孔的密度接种于96孔板中培养，放于常氧和缺氧环境下各培养24 h，按照分组加入吴茱萸碱100 μg/mL，再继续培养12、24、48、72、96 h;弃培养液，每孔加150 μL DMSO，振荡10 min;选择490 nm波长测定各孔吸光值，实验重复3次。

1.3 流式细胞术检测GBC-SD的凋亡情况

采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术进行检测。细胞分组同MTT法，取处于对数生长期的GBC-SD悬液，以密度为3.5×104个/孔接种到6孔板中，放于常氧和缺氧環境下各培养24 h，按分组加入吴茱萸碱100 μg/mL，再继续培养24 h。收集各组细胞，PBS洗涤2次后加入Annexin V-PI，再加入FITC于室温下孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.4 Western blot检测VEGF、HIF-1α蛋白表达

实验分组同MTT法，提取各组细胞的总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度检测。分别制备浓缩胶和分离胶，加样后进行蛋白电泳、转膜，用含有5%脱脂牛奶封闭后，分别用一抗（稀释倍数1∶1000）、二抗（稀释倍数1∶1000）在室温下孵育1 h，后在暗室内加超敏发光液孵育5 min，放于化学发光成像系统成像，采用Image J分析软件进行图像分析，实验重复3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t多重检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞光密度值比较

三组GBC-SD光密度值在12 h时比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;与正常对照组比较，24、48、72、96 h缺氧组细胞光密度值均降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;与缺氧组比较，吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组24、48、72、96 h的细胞光密度值均降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 各组凋亡情况比较

三组GBC-SD的凋亡率分别：正常对照组为（6.97±0.36）%、缺氧组为（17.43±0.29）%、吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组为（26.60±0.23）%，与正常对照组比较，缺氧组GBC-SD凋亡率升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组GBC-SD凋亡率高于正常对照组和缺氧组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图1。

2.3 各组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较

缺氧组GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。与正常对照组比较，吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组细胞内HIF-1α、VEGF蛋白表达水平降低，差异有统计意义（P < 0.05）;与缺氧组比较，吴茱萸碱（浓度100 μg/mL）+缺氧组细胞内HIF-1α、VEGF蛋白表达水平降低，差异有统计意义（P < 0.05），吴茱萸碱能明显抑制GBC-SD内HIF-1α、VEGF蛋白表达。三组GBC-SD细胞的HIF-1α、VEGF蛋白表达带及蛋白表达量。见图2。

3 讨论

缺氧是实体肿瘤生长过程中普遍存在的状态，HIF-1α是肿瘤细胞在缺氧应答中的重要转录调节因子[6]。由于缺氧的程度和时间不同，HIF-1α在缺氧组织细胞凋亡中发挥了双重作用。一方面，随着肿瘤体积不断增大，其生长的微环境中氧含量出现降低时，肿瘤细胞内HIF-1α蛋白的降解过程被抑制，导致其在肿瘤细胞内不断积聚，进而刺激肿瘤细胞在缺氧状态下血管生成，改善肿瘤生长微环境[7-8];另一方面，HIF-1α也能促进肿瘤细胞的凋亡，在缺氧状态下，抑制凋亡蛋白数量减少，而促进凋亡蛋白Bax及前凋亡蛋白BNIP3表达水平均增高，并与HIF-1α表达水平呈正相关;此外野生型p53与HIF-1α的氧依赖ODD相互作用促进缺氧导致的细胞凋亡[9]。

VEGF是目前已知的作用最強、特异性最高的肿瘤血管生成促进因子，它也是HIF-1α的重要靶基因之一。VEGF能促进肿瘤细胞的增殖、抑制其凋亡，并且能够诱导肿瘤细胞对放、化疗产生耐受。研究发现，肿瘤细胞高表达的HIF-1α不仅可与VEGF 5′-末端增强子相互作用，促进VEGF基因表达上调;还可增加VEGF mRNA的稳定性，促进肿瘤细胞VEGF表达增加，从而调节肿瘤血管生成，增加肿瘤的供氧能力[10-11]。在肿瘤的血管生成和生长侵袭过程中VEGF和HIF-1α两者起着相互协同的作用。多项研究提示，通过抑制HIF-1α的表达使VEGF的表达下调，可减少肿瘤组织的血管生成，抑制肿瘤组织在缺氧微环境下的糖酵解，从而抑制肿瘤生长[12-14]。

研究显示，胆囊癌组织中的HIF-1α、VEGF均为高表达状态，二者的表达量不仅与胆囊癌组织中的微血管计数呈正相关，也与患者的疾病进展成明显正相关[15-16]。细胞凋亡实验结果提示，缺氧微环境诱导胆囊癌细胞的凋亡，推测可能是由于缺氧时间较短，HIF-1α介导的促凋亡作用强于抗凋亡作用。蛋白检测结果显示，无论是在常氧环境还是在缺氧微环境下，GBC-SD内的HIF-1α和VEGF蛋白均有表达，但在缺氧的微环境下二者的表达要明显增强。GBC-SD内的HIF-1α在缺氧微环境的刺激下表达上调，并诱导其下游靶基因VEGF的表达增强。

吴茱萸碱是中药吴茱萸的有效成分，具有抗肿瘤作用[17]。大量实验结果证实，吴茱萸碱能够抑制肿瘤细胞的生长、促进其凋亡，并能抑制肿瘤细胞的侵袭转移[18-20]。吴茱萸碱可通过抑制HIF-1α使VEGF的表达下调，导致过度增殖的肿瘤细胞无法适应缺氧微环境，达到抑制肿瘤增殖的效果[21]。此外，吴茱萸碱还可通过抑制缺氧状态下肿瘤细胞HIF-1α的表达促进肿瘤细胞的凋亡[22-23]。本实验结果显示，在缺氧微环境下，吴茱萸碱能够抑制GBC-SD的增殖，同时促进其凋亡。进一步的实验结果提示，吴茱萸碱能够明显抑制GBC-SD的HIF-1α及VEGF蛋白的表达。由此，本研究认为在缺氧微环境下，通过抑制HIF-1α及其靶基因VEGF的表达可抑制GBC-SD增殖并促进其凋亡。因此，抑制肿瘤细胞HIF-1α及其靶基因VEGF的过表达，对于抑制肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡有着十分重要的意义，这为抑制肿瘤生长带来了新的思路。

综上所述，吴茱萸碱能够抑制缺氧微环境下GBC-SD的HIF-1α、VEGF蛋白的表达，使其无法适应缺氧微环境，从而抑制肿瘤细胞的生长，这为胆囊癌的治疗提供了新方向。

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（收稿日期：2019-12-16  本文编辑：封   华）