赶黄草总黄酮对活化的肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响

余 蕾，谢晓芳，彭 芙，谢 君，李梦婷，彭 成,

1成都中医药大学基础医学院，成都 610075；2四川大学药学院，成都 610021；3西南特色中药资源国家重点实验室，成都 611137

肝纤维化是一种世界性的常见病疾病，以肝内纤维结缔组织的异常增生为病理特征，主要是由于酒精肝、脂肪肝、病毒性肝炎、胆汁淤积性和代谢性肝损伤等刺激肝脏产生慢性炎症，诱导肝星状细胞活化，致使ECM的过度积累，从而导致肝纤维化[1-3]。目前，肝纤维化的治疗主要通过抗炎、抗病毒、减少ECM沉积等方式，但这些治疗效果并不理想，因此寻找有效的抗纤维化方法仍是当前的首要任务。

赶黄草又名水泽兰、水杨柳等，是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜(PenthorumchinensePursh)的干燥地上部分，始载于明代《救荒本草》[4]，具有清热活血、祛湿退黄、利水消肿等功效，可用于黄疸，水肿，跌打肿伤，以及各型肝炎、胆囊炎、脂肪肝等[5]。临床上有文献报道以赶黄草制成的单味成方制剂“肝苏颗粒”能明显改善慢性乙肝肝纤维化患者临床症状，具有降酶、退黄、促进肝功能恢复等作用，且对阻断及逆转肝纤维化有一定疗效[6,7]。课题组前期研究也证明“肝苏颗粒”对CCl4诱导所致的大鼠肝纤维化有显著的治疗作用，可改善肝功能、减轻肝脏纤维化病变。现代研究表明，赶黄草中主要含有黄酮、生物碱、多糖等成分，因黄酮成分含量较高且具有较强的抗氧化活性所以被广泛研究[8]。目前已有研究表明赶黄草总黄酮可抑制大鼠酒精性肝纤维化的形成，其抗肝纤维化作用可能与其抗氧化作用及抑制TNF-α和IL-6的分泌有关[5]。但是，赶黄草总黄酮治疗肝纤维化的具体作用机制尚不清楚，因此，本实验选用LX-2作为研究对象，采用TGF-β1刺激LX-2活化建立肝纤维化细胞模型，研讨赶黄草总黄酮抗肝纤维化的作用及可能的机理。

1 实验材料与仪器

1.1 实验药物

黄草总黄酮(total flavonoids ofPenthorumchinensePursh，TFPCP)，赶黄草购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，由成都搏屹科技有限公司提取，测得提取物中总黄酮的含量为55.3%。实验前将赶黄草总黄酮粉末溶于二甲基亚砜(DMSO)中，使用时稀释成所需浓度，各给药组中DMSO浓度均小于0.1%。

表1 赶黄草总黄酮含量测定结果

1.2 实验细胞

HSC-LX2(苏州北纳创联生物技术有限公司，货号：BNCC337957)。

1.3 实验试剂

Human TGF-β1(美国Pepro Tech 公司)、FBS(美国Gibco公司)、RPIM-1640培养基(美国Gibco公司)、MTT(德国Biofroxx公司)、Ⅰ型鼠尾胶原(杭州欣友生物技术有限公司)、α-SMA(Actin alpha，smooth muscle aorta)、FN、Col Ⅰ酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉Elabscience 公司)、兔抗Smad7多克隆抗体(美国Proteintech公司)、兔抗Smad2、phospho-Smad2、Smad3、phospho-Smad3、α-SMA抗体(美国Cell Signaling Technology公司)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 实验仪器

二氧化碳培养箱(Thermo公司)、酶标定量分析仪(Thermo公司)、MiLL-Q纯水仪(Millipore公司)、SW-CJ-1F型洁净工作台(苏净安泰集团苏州安泰空气技术有限公司)、倒置显微镜(德国蔡司公司)、电泳仪(Bio-Rad公司)、凝胶成像仪(广州博鹭滕公司)。

2 实验方法

2.1 细胞分组及处理

LX2细胞用含10% FBS和1%青-链霉素的RPIM-1640培养基培养，培养条件为：37 ℃、5% CO2，取对数生长期的细胞用于实验。在预实验中将赶黄草总黄酮药物浓度设定为5、10、15、20 mg/L时，发现浓度超过15 mg/L细胞毒性较大，而在浓度为10 mg/L时细胞存活率较高，故降低浓度间距，采用5、9、13 mg/L三个浓度进行实验。将细胞分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+赶黄草总黄酮5、9、13 mg/L组，除空白对照组以外，其余各组均使用TGF-β1(6 ng/L)处理24 h造模，造模成功后给予不同浓度的赶黄草处理24 h。

2.2 细胞活力测定

将细胞消化并重悬，调整细胞浓度为5×104个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，次日晨给予TGF-β1，作用24 h后分别给予不同浓度的赶黄草总黄酮，给药结束后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液15 μL，避光孵育4 h后将细胞液全数吸出，每孔加入150 μLDMS0，摇床上震荡混匀，用酶标仪在波长为570 nm处测量OD值(A)，计算细胞存活率：细胞存活率=(给药组A-调零孔A)/(空白组A-调零孔A)×100%。

2.3 细胞划痕试验

用标记笔在6孔板背面等距离画3条间隙为0.5 cm的虚线，用于后续拍照选取视野时定位。以1×106个/mL种板，次日给予TGF-β1造模，24 h后用10 μL的枪尖沿背面虚线在孔底画线，然后将培养液吸出，用无菌PBS轻轻冲洗将细胞碎片洗掉，分别加入含有不同浓度的赶黄草总黄酮的培养基，此时显微镜下选取视野进行拍照。培养24 h后，选择与第一次拍照相同的视野再次拍照。用Image J软件测量划痕的宽度。

2.4 细胞分泌ECM含量测定

将细胞以1×105个/mL接种于24孔板，药物作用完毕后将细胞上清液收集起来，离心去除细胞杂质，然后4 ℃保存备用，于一周内检测。检测具体操作方法按ELISA试剂盒说明书进行。

2.5 胶原收缩试验

因LX-2活化后产生的ECM可使胶原收缩，增加血管阻力、促进门脉高压[9]，故可通过体外建立三维胶原，研究赶黄草总黄酮对胶原收缩的影响。将Ⅰ型鼠尾胶原以300 μL/孔铺满24孔板底，待胶原凝固后每孔加500 μL培养液平衡胶原。将细胞将细胞以1×105个/mL接种于板内，造模完成后用枪头沿胶原边缘划一圈，使胶原与板壁分离，然后给药处理，药物作用完毕后进行拍照，观察胶原收缩情况。

2.6 TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白测定

细胞培养完成后用冰PBS清洗3遍，刮取细胞后离心，向沉淀中加入含有1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上裂解30 min提取总蛋白；测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜转移，用5% BSA室温封闭1 h，一抗4 ℃中过夜；次日用TBST洗三次后，每次8 min；二抗室温孵育1 h，然后TBST洗三次，用凝胶成像仪曝光并拍照。用Image J测量条带的灰度值。

2.7 统计学方法

3 实验结果

3.1 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2细胞活力的影响

如图1所示，与空白组相比，TGF-β1处理可促进细胞增殖(P<0.05)，而给予药物作用后，各组细胞增殖均降低，且药物浓度越高，抑制作用越明显，在9 mg/L时有显著抑制作用(P<0.05)。说明赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2的增殖。

图1 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化后的LX-2细胞活力的影响

3.2 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2细胞迁移和胶原收缩能力的影响

表2与图2示，与空白组相比，TGF-β1刺激后，细胞划痕愈合率明显增加(P<0.01)；而在给药处理的各组中，划痕愈合率与单纯给TGF-β1组相比明显降低，在9 mg/L时抑制作用显著(P<0.01)，说明赶黄草总黄酮可抑制LX-2的迁移。

图2 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化后LX-2细胞迁移的影响

表2 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化后的LX-2后的划痕愈合率

如图4示，与空白组相比，单纯给予TGF-β1刺激组，胶原收缩明显增加，而赶黄草总黄酮作用后的各组与单纯TGF-β1组相比较，胶原的收缩被明显抑制，作用效果呈剂量依赖，在9 mg/L时抑制用显著(P<0.01)。

图3 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化后LX-2细胞胶原收缩的影响

图4 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2细胞分泌FN和Col I含量的影响

3.3 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2分泌FN和Col I含量的影响

图4结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1刺激后，细胞分泌FN及ColⅠ显著增加(P<0.01)，而在给予药物作用的各组里，FN及ColⅠ含量显著减少(P<0.01)，说明赶黄草总黄酮可抑制FN及ColⅠ的沉积。

3.4 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2细胞TGF-β1/Smads 信号通路相关蛋白表达的影响

图5结果显示 在给予TGF-β1作用后，α-SMA分泌明显增加(P<0.05)，而给予药物作用后，α-SMA分泌被抑制。另外，TGF-β1作用后，Smad3、p-Smad2和p-Smad3均显著增加(P<0.01)，而给予药物作用后，其表达均有不同程度减少；Smad7在TGF-β1作用后则显著减少(P<0.05)，而给予不同浓度药物作用后Smad7的分泌有一定程度的提升，且在药物浓度达到9 mg/L时，差别具有统计学意义(P<0.01)。

图5 赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的LX-2细胞分TGF-β1/Smads 信号通路相关蛋白表达的影响

4 讨论

HSC-LX2是分布在肝脏各处的常驻的周围型细胞，在肝损伤过程中，LX-2被激活成肌成纤维细胞，产生大量α-SMA、ColⅠ等ECM，从而导致肝纤维化[10-13]。TGF-β1是一类能够调节细胞生长和分化的因子，可活化肝星状细胞，促进胶原基因表达、增加ECM沉积，是最重要的促肝纤维化细胞因子之一[14,15]。TGF-β1主要通过TGF-β1/Smads信号通路促进肝纤维化发展，TGF-β1与肝星状细胞表面受体结合，然后催化其下游Smad分子磷酸化，接着，磷酸化的Smad进入细胞核，调节其相应靶基因的转录，导致ECM产生[16,17]。Smad家族中Smad2和Smad3为受体激活型蛋白，可促进肝纤维化的进程；而Smad7则是一种抑制型蛋白，过表达可阻止Smad2和Smad3的磷酸化，抑制信号通路，减缓肝纤维化进程[18]。

本实验中，体外培养的LX-2在TGF-β1刺激后，细胞增殖及迁移速率显著增加，FN、Col I等细胞外基质大量沉积，胶原收缩明显增加，说明TGF-β1诱导肝星状细胞活化建立肝纤维化模型成立。而在给予赶黄草总黄酮处理后，细胞增殖和迁移速率被抑制，细胞外基质的沉积显著减少，胶原收缩明显降低，说明赶黄草总黄酮可抑制肝星状细胞的活化，减少细胞外基质的沉积，降低血管阻力，减缓肝纤维化的发展进程。此外，Western blot实验表明，TGF-β1作用后，Smad3、p-Smad2和p-Smad3表达均显著增加，Smad7表达则显著减少，可以说明TGF-β1/Smads信号通路被激活，而在给予赶黄草总黄酮处理后，Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达均明显减少，Smad7的表达则明显提升，说明赶黄草可抑制TGF-β1/Smads信号通路。

综上所述，赶黄草总黄抑制肝星状细胞的增殖和迁移，减少ColⅠ及FN等细胞外基质的沉积，机制与其抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。这可能是赶黄草治疗肝纤维化的机制之一。