宫颈上皮病变的联合诊断价值分析

张梅芳 吴东恩 胡蕾蕾

临床各种妇科肿瘤中，宫颈癌发病率位于前列，该肿瘤常见的病理类型为鳞状细胞癌，需要经过几年或者几十年来完成从正常上皮到宫颈上皮病变（cervical intra epithelial neoplasia，CIN），再到宫颈浸润癌的演变。宫颈癌的早期诊断及治疗在医学界中一直备受关注，为了对该病及时采取预防及治疗，目前临床上主要面临的问题是宫颈癌前病变（主要为宫颈上皮病变）的准确诊断[1]。宫颈上皮病变主要根据组织学特点进行诊断和分级，但不能排除观察者有时对组织切片误解、组织变异及其他因素的影响，使宫颈上皮病变的诊断及分级准确度不高。因此需要找到更有说服力的病理诊断证据，有研究指出[2]，相关标志物在宫颈癌前病变阶段诊断中具有良好应用价值，利于及早防治该疾病。有国外文献报道[3]，宫颈病变进展过程中，有望将Ki67、P16～（INK4a）作为重要标志物。基于此，本研究中以各种级别CIN组织作为研究对象，对其行石蜡包埋处理，同时经免疫租花对CIN中Ki67、P16～（INK4a）表达差异进行观察，分析与病变程度的相关性，以为提高临床上CIN的诊断准确性提供依据，现报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月—2017年12月于我院经病理诊断为CIN的患者90例，年龄21～65岁，平均年龄（45.35±4.73）岁。所有患者的宫颈组织切片均经专业的病理医生进行复查确认，均行石蜡包埋。将CIN标本分级，CIN Ⅰ级34例，CIN Ⅱ级26例，CIN Ⅲ级30例，CIN Ⅰ级患者年龄21～65岁，平均年龄（45.39±4.71）岁，CIN Ⅱ级患者年龄22～63岁，平均年龄（45.12±4.65）岁，CIN Ⅲ级患者年龄24～63岁，平均年龄（45.28±4.61）岁，三组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。研究获得医学伦理委员会批准，且所有患者术前均未接受放化疗，均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 所用试剂 罗氏诊断产品（上海）有限公司生产的免疫组化染色试剂盒；Ventana Bench Mark XT（瑞士，罗氏）生产的全自动免疫组化仪器；Ki67与 P16～（INK4a）鼠抗人单克隆抗体；将已知阳性切片作为阳性对照，PBS作为阴性对照。

1.2.2 取常规固定包埋的石蜡组织块标本 采用4%的中性甲醛将全部标本固定好，脱水之后进行石蜡包埋，行连续切片（3张，每张3 μm），其中1张的用途为HE染色，1张用途为Ki67免疫组化染色，1张用途为P16～（INK4a）免疫组化染色，具体染色流程为：（1）将石蜡切片厚度控制为4～5 μm，放置在烤片机（温度为65℃）中，时间控制为60 min，将标签粘贴于烤片机之后，将其放置在机器切片盘上。（2）在检测试剂架前放置各种试剂瓶，包括一抗、返蓝液、DAB试剂盒等。（3）染色时，先进行消化，然后再孵育抗体，最后进行复染，总时间控制在4 h之内。（4）采用含有清洁剂的清水对切片进行仔细重冲洗，然后再行梯度乙醇脱水操作，采用中性树脂胶将其封固。（5）内对照对象选择癌旁组织，同时需要设置阳性、阴性对照[4]。

1.3 观察指标

由1位专业性强的病理医生对免疫组化结果进行评分，并要求其在在无临床信息和HE切片诊断的情况下进行。P16～（INK4a）在胞核伴胞质或者细胞核中进行表达，Ki67则表达于细胞核中；以染色分布情况与强度为依据，获得半定量报告，可将染色程度分为棕黄色（+++）、黄色（++）、淡黄色（+）三个标准；以染色分布情况为依据，对阳性细胞百分数进行计算：在高倍镜下进行观察，随机选择10个视野（不重复），各视野均有10个细胞计数，将其平均值当成阳性细胞的百分数，具体判定标准为：P16～（INK4a）阳性细胞小于5%，则可将其判定为阴性（-），若在5%～25%之间，则可判定为（+），若在＞25%～75%之间，则可判定为（++），若在75%以上，则可判定为（+++），若着色部位只有胞质，同时只有小簇细胞着色，则可将其判定为阴性。若Ki67阳性表达只在基底旁层或者上皮基底，则可将其判定为阴性（-），若＞基底层10%～25%，则可判定为（+），若＞25%～75%之间，则可判定为（++），若超过75%，则可判定为（+++）。

分析P16～（INK4a）和Ki67在不同级别CIN中的表达，经Spearman等级相关分析P16～（INK4a）和Ki67的阳性表达与宫颈病变级别的相关性。

表1 P16～（INK4a）和Ki67在宫颈CIN Ⅰ～CIN Ⅲ中的表达（例）

表2 P16INK4a和Ki67之间的关联性

1.4 统计学方法

所有研究数据均采用SPSS 19.0进行分析，计数资料用例表示，采用χ2检验，计量资料用（±s）表示，变量间的相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16～（INK4a）和Ki67在不同级别CIN中的表达

P16～（INK4a）、Ki67的阳性表达率随CIN级别升高而升高，两者在CIN Ⅰ～Ⅲ级中的阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 P16～（INK4a）和Ki67的阳性表达与宫颈病变级别的相关性

经Spearman等级相关分析，P16～（INK4a）阳性表达率均与CIN病变级别呈正相关（r1＝0.703，P＜0.05）；Ki67阳性表达率均与CIN病变级别亦呈正相关（r2＝0.697，P＜0.05）。

2.3 P16INK4a和Ki67之间的关联性

在CINⅠ～Ⅲ中P16～（INK4a）与Ki67的阳性表达具有相关性（r＝0.715，P＜0.05），见表2。

3 讨论

P16～（INK4a）是一种抑癌基因，能直接控制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的表达。相关研究指出，P16～（INK4a）在CIN II和CIN III中的表达率明显高于CIN Ⅰ，提示了P16～（INK4a）有望利用于分LSIL和HSIL的区分[5]。本研究结果显示，P16～（INK4a）的阳性表达率随着CIN分级的增高而逐渐增高，相较于LSIL，HSIL强阳性、阳性百分比更高，且P16～（INK4a）阳性表达和宫颈上皮病变之间存在正相关性（r＝0.703，P＜0.05）。说明P16～（INK4a）的阳性表达可以作为高级别CIN的特异性标志物，提高其诊断准确性，从而为宫颈癌前病变的早期诊断及治疗提高可靠依据，并可用来评估宫颈癌前病变的发展情况[6-7]。

Ki67属于一种细胞增殖活性相关抗体，主要在细胞核中进行表达，当其表达为阳性时，能对细胞增殖活跃度进行有效反映，也可用来评估肿瘤细胞的增殖能力[8]。本研究显示，不同级别CIN中的Ki67阳性表达差异存在统计学意义，HSIL中阳性及强阳性百分率也显著高于LSIL，而且Ki67的阳性表达与宫颈上皮病变严重程度存在正相关关系（r＝0.697，P＜0.05），提示Ki67可以用于指导宫颈癌前病变的早期鉴别诊断及治疗。

有研究发现[9]，单独用Ki67诊断宫颈病变虽然漏诊率小，但存在较高的误诊率。多种生物标记物在CIN的发展过程中起到了协同作用。P16～（INK4a）和Ki67的免疫组化染色在CIN中都具有辅助分级诊断的意义，本研究结果显示P16～（INK4a）与Ki67的阳性表达具有相关性（r＝0.715，P＜0.05）。对P16～（INK4a）和Ki67进行免疫组化检测，可以分子生物学水平为依据，对癌变细胞级别进行客观评估，因此将两者联合进行检测可以有效提高诊断的准确率，并作为评估CIN发展、转归及预后的指标，从而避免了一些不必要的治疗，减少手术和日后妊娠的相关并发症，减轻患者的经济和精神负担[10-12]。

综上所述，P16～（INK4a）和Ki67联合免疫组化检测能有效提高宫颈上皮病变病理学诊断的一致性和准确性，同时结合组织学检查，能更好地提高筛查的准确性，有助于个体化治疗方案的制定。