PCR分析DNA完整性的方法探讨

杨广明 吉栩

DNA是生物和医学研究中最为常见的样本，DNA的质量决定了检测结果的准确性。对DNA的质量检测通常包括使用分光光度计测定浓度、纯度比值（OD260/280以及OD260/230）、电泳检查条带以及常规PCR扩增条带或是荧光定量PCR进行定量分析[1-7]。质量好的基因组DNA通常电泳时呈现一条约20～23 kb左右的完整条带，发生降解时主带下方会出现弥散的小条带，因此通常通过琼脂糖电泳检查DNA的完整性[1，3-7]。由于DNA降解理论上是在序列中随机发生，DNA的断裂可能导致对特定序列扩增的失败。因此在部分研究中，通过能够成功扩增出目标聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ，PCR）条带为参考标准确认DNA的完整性[4，6，7]，也有研究者使用定量PCR确定样品的完整性[1，2，8，9]，或用此方法鉴定细菌基因组的完整性[10]。但是目前仍然缺乏相对定量的标准来衡量人基因组DNA的完整性。本研究拟通过结合定量和常规PCR，探讨对基因组DNA完整性分析的效果及可能的定量方法。

1 一般材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 试剂 DNA精确定量使用QubitTMdsDNA HS Assay Kit。电泳所用的琼脂糖为Biowest品牌，50× TAE为Solarbio品牌。荧光定量使用ABI公司的PowerUpTMSYBR®Green Master Mix。PCR 酶 PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GC Buffer和 DNA Marker DL15 000为Takara公司产品，1kb ladder为NEB公司产品。PCR使用的引物由擎科公司合成。qPCR引物选择Takara公司的 Human Housekeeping Gene Primer Set中的 ATP5F1、TFRC、YWHAZ、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPS18、PPIA基因的引物对，对模板进行定量校正时选择YWHAZ基因引物对检测。

1.1.2 仪器设备 水平电泳槽JY-SPCT、核酸电泳仪为君意东方品牌，Nanodrop 2 000c微量分光光度计产自Thermo Fisher，Qubit3.0荧光定量仪和QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统为ABI公司产品，凝胶成像仪为UVItec品牌。

1.2 方法

1.2.1 DNA样本准备和梯度稀释 将DNA根据完整性不同分为3组（标号1/2/3），每组的样本来自3个人（标号S1、S2、S3）并形成对应，比如S1-1、S1-2、S1-3为来自于同一人完整性不同的样本。Qubit测定含量后，将DNA稀释到1 ng/μL。使用qPCR测YWHAZ基因CT值，根据CT值差异校正样本的模板量使所有样本起始量均一，对浓度为1 ng/μL的样本按2倍梯度稀释，获得稀释2、4、8、16、32和64倍的模板，对应稀释样品浓度为1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64 ng/μL，模板量为2 ng的样品加入了2 μL初始浓度模板。

1.2.2 DNA电泳分析和PCR扩增 分析基因组完整性和扩增所得条带时，使用1%的琼脂糖凝胶在100 V电泳35分钟，观察紫外灯下的成像情况。常规PCR扩增时，使用两个针对PAH（phenylalanine hydroxylase）基因上游序列的引物对PAH1和PAH2，以及一对针对珠蛋白基因多态性的引物HP1。PAH1正向引物为5'-ATGTTTGAGCCATATGAGTGCTC-3'，反向为5'-CTTGTGCCATAAACTTGCAGATGA-3'，目标条带大小为1 781bp；PAH2使用上述正向引物，反向引物为5'-GCTACTTGAGGGCAATGAATGT-3'，目标条带大小为3 080bp；HP1引物序列见已报道文献[11]，正向引物为5'-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3'，反向引物为5'-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3'，正常人群中基因分型Hp2-1型扩增得到1 757 bp和3 481 pb两个条带，Hp2-2型得到3 481 bp条带。PCR扩增程序为98℃ 2分钟，进入循环98℃ 15秒，60℃15秒，72℃延伸1分45秒-3分30秒，延伸时间根据片段长度进行调整设置，共扩增40个循环，然后72℃ 7分钟后完成扩增。

1.2.3 不同完整性DNA荧光定量PCR分析 用SYBR Green法10 μL反应体系，使用QuantStudio 7标准△△CT反应模式检测，分析不同DNA完整性分组的样本看家基因扩增CT值差异，并矫正模板的相对起始量。定量方法参考文献所述[12]，选择ATP5F1、TFRC、YWHAZ、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPS18、PPIA 八个基因的引物对进行分析，每个基因做三个重复取CT值均值，每个组3个样本得到24个测量值并与其他两组配对，按配对分析差异显著性。对于模板定量校正，测量YWHAZ基因CT值均值后，计算模板相对量的倍比进行校正。

1.2.4 计算和统计分析 根据完整性差异分组1/2/3，对每组24个配对的CT值，使用 SPSS 17.0 软件用两个相关样本的配对t检验分析在DNA不同完整性条件下，CT值是否存在差异显著性，P＜0.05 表示有统计学意义。为了校正不同引物对扩增效率之间的差异，以每个样品单独测量的YWHAZ基因CT值为参考基线，扣除后计算每个样本其他7个基因的△CT值，再扣除配对样本-1号对应基因的△CT值后得到△△CT值。△△CT值取负值后作为指数以2为底数计算第2/3组各个基因相对于第1组的相对拷贝倍数，使用配对t检验比较两组相对拷贝数差异。

2 结果

2.1 DNA样品完整性的电泳分析

3组完整性不同的DNA样品在提取前对同一个人的样品进行了4℃、常温以及37℃下放置处理，每组包括3个人，从而得到了降解程度不同的基因组DNA样本，从电泳图（图1）可见第1组4℃前处理的样本降解最少，约20～23 kb位置的主带清晰，完整性最好。第2组样品中样本主带清晰度下降，降解条带主要分布在主带以下至2.5 kb大小范围，第3组中样本主带较难辨认，降解条带从主带以下一直到500 bp左右均有分布。

图1 不同完整性分组DNA样品的电泳结果

2.2 qPCR分组CT值比较和初始模板量校正

2.2.1 不同完整性组间CT值和拷贝数差异 使用Qubit测定DNA含量后，取1 ng作为模板使用8组看家基因引物进行荧光定量PCR分析，每个检测做三次重复后取均值，第1组CT值均值为（24.83±2.30），第2组均值为（25.33±1.59），第3组（25.41±1.54）。配对t检验显示第1组和第2组差异无统计学意义（t=-1.963，P=0.062），和第3组差异无统计学意义（t=-1.916，P=0.068），第2组和第3组差异无统计学意义（t=-1.295，P=0.062），多组比较差异均无统计学意义。考虑到不同引物对的特异性差异，分析溶解曲线发现有6对引物的特异性更好，RPLP1、RPLP2产物存在双峰。去除这两个基因所测结果后，第1和第2组差异无统计学意义（t=-1.750，P=0.098），第1和第3组差异无统计学意义（t=-1.742，P=0.099），第2和第3组差异无统计学意义（t=-1.336，P=0.199），3组之间的差异均无统计学意义。由于8组看家基因的扩增片段均未超过200 bp，说明针对短片段的扩增不容易受基因组DNA样本完整性的影响。

以第1组样本作为参考，以YWHAZ的CT为基线计算得到的△△CT值，再计算在不同降解程度下2组和3组各个基因相对的拷贝数倍数，由于第1组作为参照组已设定为参考值“1”，仅对2和3组进行配对t检验。第2组拷贝数倍数均值为（0.90±0.15），第3组拷贝数倍数均值（0.93±0.13），和参考组倍数值1接近，两组间差异P值为为0.235，无显著差异。此结果说明，虽然第2组和3组电泳显示DNA的完整性有明显差异，但对短片段扩增产物的qPCR分析不能反映出与样本DNA完整性或者降解程度的差异。

2.2.2 初始模板量校正 为了更加准确的进行PCR模板的定量，使用qPCR测量的CT值进行校正。选择特异性最强的YWHAZ的CT值计算不同样本的模板的相对量，并根据相对倍数进行均一化。9个样本YWHAZ引物对检测的CT均值为（22.58±1.12），范围20.59～23.76。取其中最大CT值的样品作为最低浓度参考，可见初始模板量的倍数范围未超过10倍，其他8个样品CT值扣除参考值后根据△CT值的负值为指数以2为底数计算相对倍数，将样品浓度重新均一化后再进行梯度稀释。

图2 对总量梯度递减的模板进行长片段PCR的结果。

2.3 长片段PCR结果与DNA完整性的关联

由于短片段PCR不能区分DNA完整性和降解的状态，选择使用更长的片段进行PCR，结合模板的定量PCR结果均一化模板浓度后，分析对梯度稀释样品的扩增效果。针对PAH基因上游端片段设计的引物对PAH1和PAH2可以分别扩增得到1 781 bp和3 080 bp的产物，而针对珠蛋白基因多态性位点的HP1引物对可以得到1 757 bp和3 481 bp两个大小的条带，样本S1为Hp2-2型，S2、S3为Hp2-1型，三个样本均可PCR得到约3.5 kb的条带（图2）。电泳显示PAH1引物对扩增得到的1 781 bp条带虽然在S2的三个完整性不同的样品中显示出随模板完整性降低扩增条带亮度下降的趋势，但是S1和S3两组样品中没有类似现象。类似的，S2和S3两组样品中HP1引物对扩增出的1 757 bp条带的变化趋势也不同，与DNA模板完整性的降低无关联。相反的，3 080 bp和3 481 bp产物呈现了随样品完整性降低产物浓度下降的趋势。S3三个完整性不同的样本用PAH2引物对扩增的结果中，S3-2用1/2 ng DNA扩增出的条带亮度和S3-1用1/8 ng模板扩增出的条带亮度相近，也和S3-3在1ng模板量扩增出的结果相近。由此估算，在PAH2针对的基因区域，S3-2相对于S3-1，损失了大约75%左右的模板，而S3-3相对于S3-1，损失了大约87.5%左右的模板。类似的，用HP1引物对扩增时，S3-2用1 ng和1/2 ng扩增的结果分别和S3-1用1/4和1/8 ng扩增的结果相近，而S3-3用1 ng扩增条带的亮度介于S3-2用1/2和1/4 ng扩增条带亮度之间，估算出S3-2相对于S3-1在HP1针对的基因区域损失大约75%的模板，而S3-3相对于S3-1在此区域损失的模板大约87.5%～93.8%。综合两个位点的结果，相对于S3-1的完整度，S3-2的完整度大约在25%左右，而S3-3的完整度大约在6.3%～12.5%左右。通过估算，相对于S1-1，S1-2的完整度超过50%，S1-3的完整度约为12.5%～25%；相对于S2-1，S2-2的完整度超过50%，S2-3的完整度约比25%稍高。

总体来看，即使扩增片段大于1 kb，相对短的扩增片段的量并不能体现和DNA模板完整性的关联，在本研究的结果中，大于3 kb的片段有可能显示扩增效果和DNA完整性之间的对应关系。

3 讨论

本研究探讨了一种对DNA模板相对完整度的评估方法，通过分析得到同样扩增效果所需模板量相对于DNA完整性高的参照样本的比例，对DNA模板的完整程度进行一个相对量的估算。需要注意的是，本方法并非准确的定量，同时由于必须有样品作为参照，所以本方法只能对DNA相对的完整度进行大致的评估。虽然不是精确的定量，但是可以看到本方法提供了一个可能的定量检测的方向。从上述结果来看，可以提供参考的PCR产物长度不能太短，至少3 kb才能显示出关联效果。在以往的研究中，研究者对骨髓细胞提取的DNA进行了3组针对不同位点的PCR，片段长度分别为249 bp、599 bp、1 052 bp[4]，其他研究中用到的PCR分析产物大小也基本不超过1 kb[7-8]，而我们的结果显示，较短的片段对于DNA完整性、DNA降解程度的鉴定中意义不大。从电泳图可见，降解条带的分布在第2组中主要在5 kb以上，而第3组中虽然500 bp处也有分布，但是更为集中分布在2 500 bp条带上方。文献中报道的发生降解的DNA也类似，虽然有降解，但是分布在小片段区域的比例并不高[4]。考虑到DNA发生断裂的随机性，越小的扩增片段对应的模板发生断裂的可能性越低，这也是我们发现3 kb以上的片段才和DNA的完整性呈现出关联趋势的原因。因此虽然有研究报道使用了qPCR扩增的短片段鉴定DNA模板的完整性[2]，我们的结果并未显示有此关联。但是对于血浆游离的DNA，由于本身已经是较短的DNA片段，此时使用qPCR进行分析是可行的[13]，而长片段PCR反而可能不太适用，因此需要注意本研究适用的范围。另外活性氧化自由基对DNA的氧化损伤，特别是对线粒体DNA的损伤可以通过特定的定量PCR进行鉴定[14]，不过对于常规DNA提取、保存中产生的降解通常和提取前细胞的死亡以及提取、冻融中的剪切力有关，因此这种方法并不适用于常规意义的DNA完整性和降解程度的分析。值得注意的是，更长的PCR产物相对于较短的片段扩增难度更高，本研究中还选择了一个4.4 kb的目标片段，由于扩增失败未纳入分析。

我们选择的两个大于3 kb扩增区域评估DNA相对完整性，对两个区域的估算结果也存在一些差异，在同一模板低浓度模板量（1/64）的重复反应中也会出现不同的扩增结果（图2），这可能和每个PCR反应的效率，以及DNA模板分子以泊松分布方式自然的不均匀状态有关，虽然两个区域随模板梯度的变化整体的扩增趋势相同，但是如果要对整个基因组做出更准确的评估，单一位点的分析是不够准确的。本方法并不适用于对于所有基因组DNA样本完整性的快速分析，但是可以通过建立的参考标准和DNA质量参考品，来简化对常规样品质量的分析和鉴定。