木犀草素对人AC16心肌细胞损伤治疗作用的转录组学研究＊

史有阳，陈力新，秦悦农，韩向晖，孙霃平＊＊，刘 胜

（1. 上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2. 上海中医药大学中医外科研究所 上海 200032）

阿霉素（Doxorubicin，Dox）是蒽环类广谱抗肿瘤药物，也是治疗包括乳腺癌在内的一线化疗药物。然而，多种毒副反应特别是心脏毒性限制了其在临床的应用[1]。近年来，对阿霉素所致心脏毒性的机制考察主要着重于氧化应激、死亡受体、铁代谢失衡、细胞自噬凋亡和线粒体损伤等方面，但阿霉素的心脏毒性机制尚未有明确的定论[2-4]。多项研究表明，中药及有效活性成分有拮抗阿霉素心脏毒性的作用，但作用机制复杂，涉及多条信号通路[5]。

本课题组前期临床研究发现[6]，桔梗能够提高阿霉素化疗后乳腺癌病人的左心室射血分数，减轻阿霉素化疗带来的心脏毒副反应。木犀草素（Luteolin，Lut）是桔梗的主要有效成分之一[7]。为进一步明确木犀草素是否有保护心脏的作用，本课题组设计了体外实验，检测了木犀草素对阿霉素诱导的人AC16 心肌细胞损伤治疗作用。随着基因测序技术不断完善与发展，二代高通量测序技术已能全面、准确、快速地获得药物干预后细胞所有转录组信息，具有高通量、低成本和高精确率等优点[8]。本研究采用二代高通量测序平台Illumina No⁃voseq，分析木犀草素对人AC16 心肌细胞损伤治疗作用基因差异表达，探究木犀草素治疗阿霉素心脏毒性的可能靶点。

1 材料

1.1 细胞株

人AC16 心肌细胞购自上海中桥新舟生物有限公司。

1.2 试剂

本实验的试剂包括：木犀草素（购自成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-17102605，纯度≥98%）；MTT 粉 剂（美 国Sigma 公 司）；阿 霉 素、Hoechst33258 试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：SC0159；批 号：C1017）；DMEM 培 养 基（美 国Hyclone公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、青链霉素双抗、胰蛋白酶（美国Gibico 公司）；Trizol（上海生工，货号B511311）；Qubit2.0 DNA 检测试剂盒（Life Q10212）；mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina®（南京诺唯赞NR601-02）。

1.3 仪器

本实验的仪器包括：细胞培养箱（美国Thermo 公司）；Qubit2.0 荧光计Q32866 Invitrogen；PCR 仪T100TMThermal Cycler（BIO-RAD）；Benchmark PLUS 酶标仪（美国BIO-RAD 公司）；电泳仪DYY-11（北京市六一仪器厂）；生物电泳图像分析系统FR-980A（上海复日科技）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

人AC16 心肌细胞在DMEM 培养基（含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 mg/L 链霉素），37℃、5%CO2饱和湿度下进行培养，隔日传代。

2.2 阿霉素诱导人AC16心肌细胞损伤模型的建立

取5 × 103对数生长期AC16 细胞接种于96 孔板中，每孔150 μL，置于培养箱中继续培养。24 h 后，弃去培养基，每孔加入阿霉素溶液作用24 h。阿霉素终浓度为0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、4 μM、8 μM，同时设置对照孔（加入正常培养基）。每孔加入15 μL MTT 反应4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡5 min，用酶标仪测定波长为490 nm 处的光密度值（OD 值），按下式计算：细细胞增殖抑制率=（对照组OD 值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

2.3 木犀草素对阿霉素诱导的AC16 细胞存活率的影响

取5×103对数生长期AC16细胞接种于96孔板中，每孔150 μL，置于培养箱中继续培养。24 h 后，弃去培养基，每孔加入不同浓度的Lut 及Dox（1μM）作用24 h。每孔加入15 μL MTT 反应4 h，弃上清，加入DMSO 150 μL，振荡5 min，用酶标仪测定波长为490 nm处的光密度值（OD值），按下式计算：细胞增殖抑制率=（对照 组OD 值- 实验 组OD 值）/对照 组OD 值×100%。

2.4 Hoechst33258 细胞荧光染色

将对数生长期AC16 细胞，调整细胞数为3 × 105个，种入6 孔板。分为正常组、Dox 组、Dox 加Lut 组。正常组加入空白培养基，Dox 组加入1 μM 的Dox，Dox加Lut 组加入1 μM 的Dox 及20 μM 的Lut。药物处理24 h，弃培养基，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，PBS 清洗3 次，加入Hochest33258 染液（浓度为5 μg/mL），每孔1 mL，室温避光孵育15 min后，荧光显微镜下观察并随机选取3 个视野拍照，计数细胞中凋亡细胞的数目。细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.5 总RNA提取与质控

将对数生长期AC16 细胞，调整细胞数为3 × 105个，种入6 孔板。分组及给药同2.4。药物处理24 h后，弃培养基，每孔加入500 μL TRIzol。将3个重复孔细胞样品转移至RNase-free 的2 mL 离心管中，加入0.2 mL 氯仿，4℃12000 rpm 离心10 min。将上层水相移入干净的离心管中，加入等体积异丙醇，12 000 rpm 4℃离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。室温干燥10 min 后，加入50 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。Qubit 2.0检测RNA 浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况。

2.6 mRNA文库构建、测序

本研究利用Qubit2.0 RNA 检测试剂盒对Total RNA 精确定量，以确定文库构建所加入Total RNA 的量。用带有oligo（dT）的磁珠将mRNA 进行富集并片段化，以短片段RNA 为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTP、RNase 和DNA polymeraseⅠ合成二链cDNA；将纯化的双链cDNA 再进行末端修复、加A 尾并连接测序接头，连接产物纯化和片段大小分选后再进行PCR 扩增，并通过纯化获得链特异性cDNA。按照1∶1 的比例等量混合后进行测序[4]。

2.7 差异表达基因筛选及功能富集分析

采用DESeq 进行显著差异的基因分析，用Fold Change 值表示基因表达的差异倍数，按|log2（Fold Change）|＞1 且P ＜0.05，q ＜0.05 的原则筛选差异表达基因（differentiallyexpressed gene，DEG），并对筛选得到的DEG 进行聚类分析[4]。利用基因本体（Gene Ontology，GO）数据库和基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）数据库，采用R clusterprofile3.12.0 包对交集的基因进行GO 与信号通路富集分析，以校正P ＜0.05为显著性阈值[9]。

表1 不同浓度Dox对AC16细胞存活率的影响（± s，n = 4）

表1 不同浓度Dox对AC16细胞存活率的影响（± s，n = 4）

注：与正常组比较，*P ＜0.05

存活率%100.00 65.37±3.46*60.52±4.87*52.22±3.56*48.82±2.62*45.07±3.68*39.16±1.34*组别正常Dox浓度μM-0.25 0.5 1 2 4 8

表2 Lut对Dox诱导AC16细胞伤存活率影响（± s，n = 4）

表2 Lut对Dox诱导AC16细胞伤存活率影响（± s，n = 4）

注：与正常组比较，*P ＜0.05；与阿霉素组比，#P ＜0.05

存活率%100.00 54.57±2.48*63.78±2.56#64.97±6.15#68.27±3.59#组别正常Dox Dox+Lut浓度μM-1 1+5 1+10 1+20

表3 Lut对Dox诱导的AC16细胞凋亡的影响（± s，n = 3）

表3 Lut对Dox诱导的AC16细胞凋亡的影响（± s，n = 3）

注：与正常组比*P ＜0.05；与阿霉素比#P ＜0.05

凋亡率%6.00±1.00 43.67±2.08*23.33±2.52#组别正常Dox Dox+Lut浓度μM-1 1+20

2.8 统计方法

运用SPSS 21.0 进行统计学分析，实验数据以均数±标准差(xˉ±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用t检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度阿霉素对AC16细胞存活率的影响

正常组AC16 细胞生长良好，经过0.25-8 μM Dox处理24 h 后，细胞生长活力呈现出不同程度的抑制，并呈明显的浓度依赖性（P ＜0.05），结果见表1。根据Dox 对AC16 细胞生长抑制的情况，后续实验选用Dox 1μM作用24 h建立心肌细胞损伤模型。

3.2 木犀草素对阿霉素诱导AC16 细胞损伤存活率影响

与正常组比较，Dox组AC16细胞存活率显著降低（P ＜0.05）；与Dox 组比较，不用浓度Lut 处理后，AC16细胞的存活率明显提升，细胞的存活率较Dox 组有显著差异（P ＜0.05）。具体见表2。

3.3 Hoechst33258 染色检测细胞凋亡的形态学

正常AC16 细胞核呈现均匀低强度蓝色荧光，形态规则，呈椭圆形状，存在一定比例的凋亡细胞，细胞凋亡率为6.00%±1.00%。经Dox 处理后，细胞核呈固缩致密浓染，形态不规则染，凋亡细胞比例为43.67%±2.08%，显著高于正常组（P ＜0.05）；Dox 加Lut 组细胞核形状由不规则固缩致密浓染转为规则椭圆形，可不同程度减轻Dox 引起的细胞凋亡，凋亡细胞比例降至23.33%±2.52%（P ＜0.05）。见图1、表3。

3.4 各组细胞差异基因表达情况

将各组AC16 细胞转录组测序获得的基因表达量进行标准化处理，两组进行比较，筛选出差异基因，筛选条 件 为P-value＜0.05 且qValue＜0.05，和Fold change 大于2 倍及小于0.5 倍。如图2、表4 所示，Dox组与正常组进行比较得到3637个差异基因，其中上调基因1 723 个，下调基因1 914 个；Dox 加Lut 组与Dox组进行比较得到212 个差异基因，其中上调基因52个，下调基因160个。

图1 Hoechst 33258荧光染色法观察AC16细胞凋亡的结果，白色箭头所示为凋亡细胞（400 X）

图2 细胞差异表达基因散点图

图3 细胞交集基因韦恩图

表4 细胞差异表达基因统计表

3.5 差异表达基因GO富集分析

为了找到与用药相关的差异基因，选取Dox 组对比正常组中上调且Dox加Lut组对比Dox组下调的137个基因；选取Dox组对比正常组中下调且Dox加Lut组对比Dox 组上调的32 个基因（图3），对以上的交集基因进行GO 富集分析。鉴于差异表达基因数目较多，本研究从细胞组分、生物过程和分子功能3 大功能类别中各选取富集最显著的10个GO term绘制柱状图进行展示。图4显示，生物过程富集的基因变化最强，其次是细胞组分，最后是分子功能。在生物过程类别中，主要变化的有细胞骨架、囊泡微管运输，以及顺向轴突输送、内质网应激、钙离子内流等功能；在细胞组分类别中，主要变化是高尔基腔、细胞突触和基底膜，在分子功能中，富集差异基因也主要与细胞膜结构相关，主要包括细胞周期蛋白调节，氧化应激、囊泡微管运输等。上述结果表明，Dox主要对AC16心肌细胞骨架造成损伤，Lut 能够从细胞骨架结构功能等方面改善Dox对AC16心肌细胞造成的损伤。

3.6 差异表达基因KEGG通路富集分析

以P ＜0.05 为显著性阈值，对交集基因进行KEGG 富集分析，以最显著变化的25 个通路绘制散点图（见图5），其中涉及的信号通路包括：化学致癌信号通路、细胞衰老、转录失调、代谢通路、AMPK 信号通路、细胞凋亡通路、mTOR信号通路等。

4 讨论

图4 细胞交集基因GO富集分析结果

化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但很多化疗药物具有显著心脏毒性，尤其以蒽环类药物最为明显。阿霉素亦称多柔比星，是一种抗肿瘤抗生素，可抑制细胞RNA 和DNA 的合成，属周期非特异性药物，对多种肿瘤均有作用[10]。阿霉素存在严重的心脏毒性，主要表现为长期使用导致心肌病和慢性充血性心力衰竭[11]。有研究表明，当阿霉素累计使用剂量超过550 mg/m2时心脏毒性尤为明显[12]。目前，右丙亚胺是唯一被FDA 批准用于预防蒽环类药物所致心脏毒性的药物，然而由于价格昂贵及严格的适应症限制了其临床应用[13]。

随着中西医结合防治肿瘤研究的不断深入，以传统中医理论为指导，与现代前沿的医学理论和研究成果相结合，从中药中筛选出具有降低化疗药物心脏毒性的研究上取得了一些进展。周君等[14]观察三黄抗氧化方改善乳腺癌患者术后蒽环类药物化疗心脏毒性的效果，结果表明，三黄抗氧化方通过抗氧化应激机制，效清除体内过度自由基和氧化物，保护心肌细胞，从而缓解乳腺癌术后蒽环类药物化疗所致的心脏毒性。许茸茸等[15]发现，当归红芪超滤膜提取物可减轻阿霉素对心肌细胞DNA 的损伤，提高Bcl-2/Bax 表达水平从而抑制心肌细胞的凋亡，具有抗心肌细胞凋亡的保护作用。曲震理等[16]报道，川芎嗪具有对阿霉素所致心肌细胞氧化损伤的保护作用，其机制可能与其抗氧化、抗自由基作用有关。

桔梗为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根，味苦辛、性平，归肺经，具有宣肺利咽、祛痰排脓的功效。前期研究表明[17]，在治疗乳腺癌肺转移小鼠中，桔梗与阿霉素联合应用，可在一定程度上提升乳腺癌肺转移小鼠左心射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）水平，增强心脏泵血功能；同时，桔梗与阿霉素联合应用可促进阿霉素向靶向组织肺脏聚集并减缓消除，减少其向非靶向组织心脏的分布并加快消除。但其具体药物活性成分及作用机制并不明确。

图5 细胞交集基因KEGG富集分析结果

木犀草素是一种天然黄酮类物质，具有多种药理活性，存在于包括桔梗在内的多种药用植物中。Xiong等[18]实验表明，木犀草素通过HO-1 介导的抗炎和抗氧化作用，保护脂多糖诱导的小鼠重症急性胰腺炎。心肌缺血再灌注可发生严重的心律失常而导致猝死。Zhang等[19]发现，木犀草素预处理对体外心肌细胞及缺血再灌注大鼠心肌有保护作用，其机制可能与下调NOX2 表达及p38/MAPK 磷酸化水平有关。本实验通过体外建立阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型，通过检测细胞存活率及凋亡相关指标，观察木犀草素对人AC16 心肌细胞损伤治疗作用。研究结果显示，阿霉素干预人AC16 心肌细胞后，心肌细胞生存率降低，细胞发生凋亡。而与阿霉素组相比，木犀草素能够提高细胞生存率，抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡。

作为基因组学研究的重要组成部分，转录组学是一门在整体水平上研究细胞和组织中所有基因的表达和调控的学科[20-21]。何升华等[22]基于转录组学测序（RNA-Seq）技术探讨临床经验方腰突颗粒防治腰椎间盘退变的可能分子机制，结果显示，差异表达基因共有464个，其中上调基因有143个，下调基因有321个。差异基因的GO功能显著性富集分析显示，差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程中。差异基因的信号通路显著性富集分析结果发现，主要集中在代谢相关通路。李冰涛[23]基于转录组学对葛根琴连汤治疗型糖尿病的作用机制进行研究发现，葛根芩连汤14 组20 多个肝基因表达出现显著差异，多与糖脂代谢相关。13个与糖脂代谢及炎症反应基因己被单基因检测证实。重要肝基因PPA、CEBP 和SREBP-1C表达上升，IRS2介导的PI3K信号转导途径被修复。

本实验采用二代基因测序的方法，对木犀草素保护阿霉素诱导的人AC16 心肌细胞损伤差异基因的表达进行了转录组测序。实验结果表明，药物作用后，各组细胞的转录组水平发生了显著改变，共筛选出了3 637 个差异基因。通过GO 及KEGG 富集分析发现，差异表达基因涉及多条通路，如细胞骨架、囊泡微管运输及钙离子内流等。细胞骨架对维护细胞正常结构、保持胞膜的完整性和执行心肌收缩舒张功能有重要作用[24]。研究表明，心肌细胞骨架信号通路异常在心肌缺血再灌注，心肌肥大等疾病中发挥重要作用[25]。细胞囊泡是由质膜脱落的直径在100-1000 nm 的微小囊泡，是细胞结构改变的重要组成部分，当细胞生理发生改变或受到外来刺激时，细胞内钙离子超载，质膜失去平衡，细胞膜褶皱形成囊泡释放到细胞外，导致心脏相关疾病的发生[26]，本实验研究发现，木犀草素作用细胞后，差异基因主要富集于细胞骨架、囊泡及结构相关通路中，因此调控心肌细胞骨架及细胞结构损伤可能是抑制细胞凋亡的关键机制。

综上所述，木犀草素抑制阿霉素诱导的人AC16细胞凋亡机制，可能是通过改善阿霉素对心肌细胞骨架损伤、细胞结构等发面发挥作用，但具体靶点基因复杂，后期有将针性的对上述信号通路中的差异靶点基因进行筛选及验证，为进一步研究提供基础。